갤러리아 mellonella 구강 관리 모델 Study Commensal-Induced 타고 난 면역 반응에

Summary

여기, 우리 갤러리아 mellonella 애벌레를 사용 하는 구강 관리 모델에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 특성화 하는 방법을 타고 난 면역 반응 유도. 이 프로토콜을 사용 하 여, 실제적인 경험 없이 연구원 G. mellonella 강제로 메서드를 사용할 수 있게 됩니다.

Abstract

숙주 면역 체계에 공생 박테리아의 면역성 잠재력의 조사 장 호스트-미생물 상호 작용을 공부 하면 한 필수 구성 요소입니다. 그것은 잘 다른 공생 호스트 장 면역 체계를 자극 하는 다른 잠재력을 전시 설립. 이러한 조사는 척추 동물, 특히 설치류를 포함 한다. 이후 증가 윤리적인 우려 척추 동물을 포함 하는 실험과 함께 연결, 무척 추 동물 대체 모델에 대 한 높은 수요가 있다.

여기, 우리는 G. mellonella 면역 시스템에 공생 비 병원 성 박테리아와 공생의 면역성 잠재력의 가능한 평가 사용 하 여 갤러리아 mellonella 구강 관리 모델을 제공 합니다. G. mellonella Bacteroides vulgatus , 대장균등 다른 면역성 잠재력과 공생의 분석을 허용 하는 유용한 다른 무척 추 동물 대체 모델은 설명 합니다. 흥미롭게도, 박테리아 전시는 포유류와 비슷한 애벌레에 죽이 효과가 없습니다. G. mellonella 의 면역 반응 척 추가 있는 타고 난 면역 반응에 대 등 했다 하 고 박테리아의 인식 및 항균 분자의 생산을 포함 한다. 우리가 제안 하는 G. mellonella 건강 한 포유류 개인에서 잘 알려진 이전 microbiota 균형을 복구할 수 있었다. 제공 하는 G. mellonella 및 척추 동물에 비해 타고 난 면역 반응, 비록 G. mellonella 는 적합 한 면역 계통 항구 하지 않습니다. 타고 난 면역 체계의 구성 하는 조사 요소는 진화 보존, 모델 세균 면역성 속성의 첫 번째 해 분석을 수 있습니다.

Introduction

장내 미생물의 항상성 유지를 위한 필수 구성 요소 이며 모두 타고 난 및 적응형 면역 반응^1,2를 포함 한다. 공생 microbiota 커뮤니티 다른 주요 공생 성분에 의해 특징입니다: symbionts 중요 한 immunomodulatory 기능을 가질 수 있는 해로운 효과 유전으로 predisposed pathobionts 효능 효과 부여 호스트 및 홍보 하 고 방 아 쇠 창 자 염증^3,4. Symbionts 및 pathobionts에 대 한 많은 연구와 숙주 면역 체계에 영향을 미치는 그들의 주로 공부 적응 면역 응답 출판 되었습니다.

이러한 연구 조사와 보호에 대 한 많은 동물 포함 동물 실험에 대 한 사용의 공공 이익 증가의 이후 우리는 찾을 수 있도록 다른 박테리아의 심사에 대 한 면역성 대체 모델 추구 속성입니다. 곤충, 특히 갤러리아 mellonella, 감염 연구에서 널리 사용 되는 대체 모델은. G. mellonella 는 낮은 비용, 높은 처리량; 등 다른 장점 결합 그것은 자연 노출....

Protocol

1. G. mellonella 양육 및 실험에 대 한 애벌레의 준비

참고: 마지막 유 충 탈피를 달걀에서 주기 약 5-6 주 걸립니다.

1. 성인 나 방 2 L 상자 포함 하는 왁 스 나 방 기판 (22% 옥수수 밀가루, 22% 밀 식사, 17.5% 밀랍, 11% 무 지방 우유 분말, 꿀 11%, 11% 글리세롤, 5.5% 건조 효 모)에 의해 누워 계란을 전송 합니다. 어둠 속에서 30 ° C에서 번 식 하는 전체를 수행 합니다.
2. 애벌레를 포함 하는 때 작고 작은 애벌레 표시 했다 약 1-2 주 후에 신선한 기판으로 기판의 25 g을 전송 합니다. 그들의 크기에 따라 2 주 후 애벌레를 동기화 하 고 추가적인 2 주 동안 왁 스 나 방 기판에 2 L 용기에 30-40 애벌레의 그룹을 유지.
3. 무게에 의해 실험에 대 한 애벌레를 선택 합니다. 180-200 mg의 질량만 창백 하 고 빠른 움직이는 애벌레를 사용 합니다.

2. 재배 및 Bacteroides vulgatus 및 대장균 의 구강 관리에 대 한 준비

1. Anaerobically는 혐 기성 환경을 만들기 위한 항아리와....

Results

G. mellonella hemolymph 감염 모델에는 다양 한 병원 체의 독성 요인 분석에 널리 사용. 대부분 측정 애벌레 사망률은 매우 쉬운 방법의 분석을 포함 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드는 일반적 면역 반응에 대 한 결론을 허용 하지 않습니다 고 척 추가 있는 면역 메커니즘 G. mellonella 면역 반응의 결과 연결. G. mellonella 구강 관리 모델 다른 한편으로 거의 사용 됩니다 구강 감염 또는 어려움 때문에 애벌레의 식민지에 대 한 정확한 감염 복용량⁹를. 또한, 약간 비 병원 성 박테리아 특히 포유류 장내 공생으로 G. mellonella 타고 난 면역 반응에 대 한 알려져 있다.

병원 체, 달리 공생 도전 호스트 및 .......

Discussion

G. mellonella 모델은 조직의 감염 접근²¹세균 독성 요인 평가 하기 위해 자주 사용된 모델. 이후 많은 병원 균과 박테리아 구두 식민지 또는 감염 경로 통해 호스트를 입력, 새로운 통찰력 G. mellonella 구두 식민과 감염에 대 한 모델로 평가를 찾이 필요가 있다.

G. mellonella 15-37 ° C 사이 가능성은 큰 장점이 있기 때문에 대부분 포유류 모델 37 ° C⁵의 체온을 유지. G. mellonella 애벌레는 다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다 하지만 자신의 번 식 인구의 설립 방해는 분석 실험, 실험을 시작 하는 때 추정을 더 나은 하는 항생제의 부재 등 많은 이점을 제공 합니다. 공급 업체 제공 하지 않습니다 항상 애벌레 준비-사용 단계에서 스트레스 응답 교통 또는 온도 변화는 피할 수 있.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 튜브	Eppendorf	0030120086
100 bp DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	15628019
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)	Sigma-Aldrich	B9673
2 mL tubes	Eppendorf	0030120094
2x Mangomix	Bioline BIOLINE	BIO-25033	Colony PCR
50 mL tube	Greiner Bio-One	210 261
Agarose	Biozym	840004
밀랍	Mixed-Store.de	-
뇌 심장 주입 육수	Thermo Fisher Scientific	CM1135
CloneJET PCR 클로닝 키트	Thermo Fisher Scientific	K1232	16S 단편용 클로닝 벡터
옥수수 가루	Ostermü hle Naturkost GmbH	306	유기농 재배
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton Dickinson	BD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Becton Dickinson	244610
DNA-free DNA 제거 키트	써모 피셔 사이언티픽	244510	Dnase 소화
건조 효모	Rapunzel	-	유기농 재배
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14040
Ethanol	VWR	20821.330
Glycerol	Sigma-Aldrich	W252506
Honey	Ostermü hle Naturkost GmbH	487
이소프로판올	VWR	20842.330
Lightcycler 480 Instrument II	Roche 분자 시스템	5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, 흰색	Roche 분자 시스템	4729692001
디지털 디스플레이가 있는 수동 마이크로 주사기 펌프	World Precision Instruments	DMP
Micro-Fine+ U-100 인슐린 주사기 0.3 x 8 mm	Becton Dickinson	324826	경구 투여
모르타르, 유약을 바르지 않은	VWR	410-9327
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
뉴클레아제가 없는 물	Thermo Fisher Scientific	10977035
Oxoid AnaeroGen 봉지	Thermo Fisher Scientific	AN0025A	RNA
PCR 줄무	Biozym	710970
Pestle, 유약을 바르지 않은 연삭 표면	VWR	410-9324
Phusion 교정 효소	Thermo Fisher Scientific	F553S
프라이머	바이오머	-
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222
QuantiFast SYBR Green PCR 키트	Qiagen	204056	세균 복제 수 측정을 위한 qPCR
QuantiFast SYBR Green RT-PCR 키트	Qiagen	204156	qRT-PCR 유전자 발현 측정을 위한
QuantiTect 역전사 키트	Qiagen	205311	cDNA 합성
큐비트 어세이 튜브	Thermo Fisher Scientific	Q32856
큐비트 dsHS DNA 키트	Thermo Fisher Scientific	Q32851	플라스미드 및 cDNA 샘플의 정량화
Qubit 형광계	Thermo Fisher Scientific	Q33226	플라스미드 및 cDNA 샘플의 정량화
RNase-ExitusPlus	AppliChem	A7153
Rnasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2511
탈지 분유	Sucofin	-
SYBR 안전 DNA 젤 스테인	써모 피셔 사이언티픽	S33102
TRI 시약	Sigma-Aldrich	T9424
계량 보트	VWR	10803-148
밀 가루	Ostermü hle Naturkost GmbH	6462	유기농 재배