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방법 논문

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

9K 조회수

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DOI:

10.3791/59273

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2019년 8월 25일

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1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 짧은 처리 시간, 낮은 비용 및 높은 처리량의 장점을 가진 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 염기서열 분석 방법을 소개합니다.

초록

염색체 이수성, 배아 발달 체포, 이식 실패, 또는 임신 손실로 이끌어 내는 주요 원인의 한개는, 인간 적인 태아에서 잘 문서화되었습니다. 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 배아의 염색체 이상을 검출하여 생식 결과를 크게 향상시키는 유전자 검사입니다. 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근 방식을 제공하며 PGT-A에서 임상 적용가능성을 보여주었습니다. 여기서, 우리는 배아에서 이수성 의 스크리닝을 위한 신속하고 저비용 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시한다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 그 다음에는 시퀀싱 라이브러리의 시딩 및 반도체 시퀀싱 시스템의 후속 시퀀싱이 뒤따릅니다. 일반적으로 PGT-A 애플리케이션의 경우 각 칩에 24개의 샘플을 로드하고 시퀀싱하여 150개의 기본 쌍의 평균 판독 길이에서 60-8000만 개의 판독을 생성할 수 있습니다. 이 방법은 시퀀싱 라이브러리의 템플릿 증폭 및 보강을 수행하기 위한 정교한 프로토콜을 제공하여 PGT-A 감지를 재현 가능, 높은 처리량, 비용 효율적이고 시간 절약으로 만듭니다. 이 반도체 시퀀서의 실행 시간은 2-4 시간이며 샘플 수신에서 보고서 발행까지 소요 시간이 5 일로 단축됩니다. 이 모든 이점은 이 분석법을 배아에서 염색체 이수성을 검출하고, 따라서 PGT-A에 있는 그것의 넓은 응용을 촉진하는 이상적인 방법합니다.

서론

보조 생식에 있는 전송을 위한 일반적인 염색체 사본 수 (euploid)를 가진 좋은 질 실행 가능한 태아를 선택하는 것은 임신 결과를 향상하는 것을 돕습니다. 전통적으로, 잘 확립 된 형태 학적 등급 시스템은 쉽게 가용성과 비 침습적 특성으로 인해 배아 평가에 널리 사용됩니다. 그러나, 형태학적 평가는 배아 질1 및 이식 잠재력2에대한 제한된 정보만 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 한 가지 근본적인 이유는 배아의 염색체 조성을 평가할 수 없기 때문입니다.

염색체 이수성 (염색체의 비정상적인 카피 수)은 배아 발달 체포, 이식 실패 또는 임신 손실로 이어지는 주요 원인 중 하나입니다. 이수성의 발생은 인간 배아에서 잘 문서화되어 있으며, 골반포 낭포제3,4 및 50 %-60 %에서 60 %를차지합니다5. 이는, 어느 정도, 체외 수정 (IVF) 치료의 임신 율을 개선에 병목 현상에 기여하고있다, 이는 약에서 유지하고있다35%-40% 6,7. 그러므로, 전송을 위한 euploid 태아를 선택하는 것은 임신 결과 향상을 위해 유익할 것으로 믿어집니다. 이를 위해, 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 유전 적 접근을 사용하여 배아 생존가능성을 조사하기 위해 추가로 개발되었다. PGT-A의 중요한 역할을 지원하는 무작위 통제 실험 및 코호트 연구의 수가 증가하고 있습니다. PGT-A의 적용은 유산율을 감소시키고 임상 임신율과 이식율 8,진행 중인 임신율 및 출산율9를증가시키는 것으로 입증되었다.

역사적으로, PGT-A에서 다양한 방법이 적용되어 왔으며, 이러한 경우 형광은 체자형화(FISH), 비교 게놈 혼성화(CGH), 어레이-CGH, 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)-마이크로어레이이다. 이전 연구는 물고기에 의한 분열 단계 배아에 대한 PGT-A가 59273array-CGH 또는 를 사용하여 해당 배반포의 포괄적 인 염색체 스크리닝 (CCS)에 의해 얻은 것과 제대로 일치하지 않는 결과를 산출한다는 것을 나타났습니다. SNP-마이크로어레이5927310. 이러한 불일치는 개발11동안 염색체 분리 오차의 염색체 모자이크, FISH 기술 적 유물 또는 배아 자기 교정에 기인할 수 있다. 어레이-CGH 또는 SNP-마이크로어레이와 같은 어레이 기반 PGT-A에 대한 배반포 트로프토더(TE) 생검을 사용하는 것이 배아10,12에서염색체 불균형을 식별하는 데 효과적이라는 것이 널리 인식되고 있다. 최근, 단세포 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근법을 제공하며 PGT-A13,14,15에서임상 적 적용성을 보이고 있으며, 이는 현재 사용 가능한 방법에 대한 유망한 대안.

여기에서, 우리는 인간 배아에서 이수성의 검열을 위한 빠르고, 견고하고, 저가의 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시합니다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 단일 세포 WGA 키트를 사용한 다음 시퀀싱 라이브러리를 시빙하고 반도체 시퀀싱 시스템에서 후속 시퀀싱을 수행합니다.

DNA 가닥 합성 시 각 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 혼입에서 방출되는 H+ 이온을 검출함으로써, 시스템은 반도체 소자로부터 포착된 화학적 신호(pH 변화)를 디지털 데이터를 직접 전달한다. , 이는 DNA 서열 정보로 더 해석된다. 고가의 광학 검출 및 복잡한 시퀀싱 반응에 대한 요구 사항을 제거한 이 간단한 시퀀싱 화학은 총 시약 비용을 줄이고 시퀀싱 실행 시간을 2-4시간16시간으로단축합니다. 더 중요한 것은 제조업체의 성능 사양에 따라 반도체 시퀀싱 플랫폼은 실행당 최대 15GB 의 시퀀싱 데이터(라이브러리 품질에 따라 다름)를 생성할 수 있으며, 이는 다른 시퀀서보다 훨씬 높다는 것입니다. 약 3-4GB 데이터(2 x 75bp 읽기 길이)만 생성합니다17. PGT-A의 임상 적용에서 이 플랫폼은 칩당 24개의 샘플을 생성하여 최대 8,000만 개의 읽기17개 및 각 샘플의 최소 100만 개의 고유 판독을 달성할 수 있습니다. 판독 깊이는 각 샘플이 적어도 0.05x 전체 게놈 커버리지를 가지고 있는지 확인할 수 있습니다. 이 플랫폼의 위의 장점은 이상적인 스크리닝 방법을 만들어 PGT-A18의광범위한 응용 프로그램을 용이하게합니다.

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프로토콜

홍콩 공동 중국대학-신계 동쪽 클러스터 임상 연구 윤리위원회(참조 번호: 2010.432)에 의해 윤리적 승인이 부여되었습니다. 연구 라이센스는 홍콩의 인간 생식 기술위원회 (번호 R3004)에 의해 승인되었습니다.

1. 전체 게놈 증폭

  1. 시작하기 전에 자기 비드 (재료표)의 부피를 확인하여 각 샘플에 대해 135 μL (20 % 초과)이 없는지 확인하십시오. 자기 비드를 실온(RT)에서 30분 이상 유지하십시오. 각 샘플에 대해 70% 에탄올의 720 μL(20% 초과)을 준비합니다. 열 사이클러(재료표)를 105 °C에서 가열 된 뚜껑을 장비하십시오.
    참고 : 새로 준비 된 70% 에탄올 (재료 표)은 3 일 이내에 사용해야합니다.
  2. 샘플 준비
    참고 : 일상적인 연습에서, 배반포의 5 ~ 10 trophectoderm 세포는 연습 지침19에따라 생검된다.
    1. 단일 0.2 mL 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 튜브에서 1x 인산 완충 식염수 (PBS)의 2 μL에서 생검을 일시 중단하십시오.
    2. 작은 원심분리기에서 튜브를 3초 간 간단히 돌리면 물방울을 수집합니다.
  3. 세포 분석 및 추출
    1. 세포 추출 완충제(표 재료)와 추출 효소 희석 완충제(표의 재료표)를 얼음, 소용돌이에 해동하고 사용하기 전에 미니 원심분리기를 3초 간 간략하게 돌린다.
    2. 1.2.2단계에서 각 튜브에 3 μL의 세포 추출 버퍼를 추가합니다.
    3. 추출 효소 희석 완충액 4.8 μL 및 0.2 μL 세포 추출 효소(표 재료)를첨가하여 각 시료에 대해 5 μL 세포 용해 마스터 믹스를 준비한다. 1.3.2 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양치를 섞습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집고 미니 원심 분리기를 3초 동안 간단히 돌봅입니다.
      참고 : 팁마스터 믹스를 추가 할 때 세포 샘플을 포함하는 액체를 만지지 않아야합니다.
    4. 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 1.3.3 단계에서 튜브를 배양합니다. 다음과 같은 설정으로 프로그램을 실행합니다: 75°C에서 10분, 95°C에서 4분, 4°C에서 유지합니다.
  4. 전암화
    1. 얼음, 소용돌이에 전암화 버퍼(재료의 표)를해동하고 사용하기 전에 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 잠시 회전.
    2. 4.8 μL의 프리앰블화 완충액과 0.2 μL의 프리앰블화 효소(재료 표)를 첨가하여 각 시료에 대해 5 μL 프리앰블화 마스터믹스를준비한다. 1.3.4 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양치를 섞습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집고 미니 원심 분리기를 3초 동안 간단히 돌봅입니다.
      참고 : 팁마스터 믹스를 추가 할 때 DNA 샘플을 포함하는 액체를 만지지 않아야합니다.
    3. 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 튜브를 배양하십시오. 흐르는 설정으로 프로그램을 실행 : 95 ° C에서 2 분; 95°C에서 15s, 15°C에서 50s, 25°C에서 40s, 35°C에서 30s, 65°C에서 40s, 75°C에서 40s; 4 °C에서 유지합니다.
  5. 증폭
    1. 얼음, 소용돌이에 증폭 버퍼(재료의 표)를해동하고 사용하기 전에 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 잠시 회전.
    2. 증폭 버퍼 25 μL, 증폭 효소 0.8 μL(재료 표) 및 WGA용 뉴클레아제없는 물 34.2μL을 추가하여 각 샘플에 대해 60 μL 증폭 마스터 믹스를 준비합니다(재료 표). 1.4.3 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양치를 섞습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집고 미니 원심 분리기를 3초 동안 간단히 돌봅입니다.
    3. 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 튜브를 배양하십시오. 다음과 같은 설정으로 프로그램을 실행 : 95 ° C에서 2 분; 95°C에서 15s에 대한 14 사이클, 65°C에서 1분, 75°C에서 1분; 4 °C에서 유지합니다.
  6. 의 정화 이 에 WGA 제품
    1. 각 WGA 제품을 1.5.3단계에서 새로운 1.5mL 튜브로 옮김. 각 튜브에 112.5 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 소용돌이와 5 분 동안 RT에서 배양.
      참고: 사용하기 전에 마그네틱 비드를 완전히 섞으세요.
    2. 튜브를 마그네틱 스탠드(재료표)에 3분 간 놓고 상급제가 분명해질 때까지 놓습니다. 구슬을 방해하지 않고 모든 상급을 버리십시오.
    3. 각 튜브에 70% 에탄올300 μL을 추가합니다. 각 튜브를 180° 회전하여 구슬이 에탄올을 통과하고 원래 위치로 다시 회전하도록 합니다. 구슬을 방해하지 않고 정착 한 후 모든 상급을 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.
      참고: 튜브를 수평으로 회전하는 동안 마그네틱 스탠드에 튜브를 고정합니다.
    4. 3s. 튜브를 자기 스탠드에 놓고 잔류 상한자가 명확해질 때까지 각 튜브를 미니 원심 분리기에서 간단히 돌봅입니다. 구슬을 방해하지 않고 모든 잔류 상수체를 버린다. RT에서 구슬을 약 3분 동안 건조시면 됩니다.
    5. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 35 μL의 낮은 Tris-EDTA (TE) 버퍼(재료표)를 추가하여 말린 구슬을 다시 일시 중단하십시오. RT에서 5분 동안 배양합니다.
    6. 상급체가 명확해질 때까지 튜브를 자기 스탠드에 3분 동안 놓습니다. 용출된 DNA를 함유한 모든 상급물질을 구슬을 방해하지 않고 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.

2. WGA 제품의 품질 관리

  1. 제조자의 설명서에 따라 1.6.6 단계부터 WGA 제품의 1μL을 원료로 사용하여 제조자의 설명서에 따라 각 정제 된 WGA 제품을 정량화합니다.
    참고: WGA 제품의 허용 농도는 ≥ 10 ng/μL입니다. 이 임계값 미만의 제품은 다음 단계로 진행하지 않는 것이 좋습니다.

3. WGA 제품의 조각화

  1. 시작하기 전에 드라이 블록 히터를 37 °C로 예열합니다. 각 샘플에 대해 0.5 M EDTA의 6 μL(20% 초과)을 준비합니다. 농도에 기초하여, 각 정제된 WGA 제품으로부터 의 DNA 300 ng을 새로운 0.2 mL PCR 튜브로 1.6.6 단계로 하고 각 튜브에 뉴클레아제 없는 물로 16 μL로 부피를 가져온다.
  2. 조각화
    1. dsDNA 단편화 반응 완충액 2 μL(재료 표)과 dsDNA 단편화 효소 2μL(재료표)을 첨가하여 각 시료에대해 4 μL 이중 연선 DNA(dsDNA) 단편화 반응 혼합물을 준비한다. 3.1 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양칭을 섞습니다. 소용돌이및 3s. 가열된 뚜껑이 있는 열 사이클러에서 37°C에서 25분 동안 튜브를 인큐베이션하는 미니 원심분리기에서 잠시 회전시다.
    2. 각 튜브에 즉시 0.5 M EDTA의 5 μL을 추가합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 잠시 회전.
  3. 정화 및 재서스펜션
    1. 각 제품을 3.2.2단계에서 새로운 1.5mL 튜브로 옮김. 각 튜브에 37.5 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 정점으로 섞고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 1.6.2 단계부터 1.6.4 단계까지 설명된 대로 제품을 정제한다.
    3. 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 32 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다.

4. 도서관 건설

  1. 무딘- 전자 (것)이 nd r 이도, 크기 선택 및 정제
    1. 각 샘플에 대해 9.5 μL의 뉴클레아제 없는 물, 10 μL의 5x 말단 수리 버퍼를 추가하여 각 샘플에 대해 20 μL 무딘 말단 수리 믹스를 준비합니다(3.3.3단계의재료튜브 표. 소용돌이와 3 s에 대 한 미니 원심 분리기에 간단히 회전.
    2. 4.1.1단계에서 각 튜브에 50 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 소용돌이와 5 분 동안 RT에서 배양.
      참고: 사용하기 전에 마그네틱 비드를 완전히 섞으세요.
    3. 각 튜브를 자기 스탠드에 3분 동안 놓고 상급제가 분명해질 때까지 놓습니다. 모든 상급을 각각 25 μL 자기 구슬이 추가되는 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김. 이송된 상상과 튜브를 소용돌이시키고 RT에서 5분 동안 배양한다.
    4. 1.6.2단계부터 1.6.4단계까지 설명된 바와 같이 배양된 튜브에서 제품을 정제한다.
    5. 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 32 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다.
      참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 이 단계에서 정제된 DNA는 24시간 이하의 4°C에서 안정하다.
  2. 어댑터 l igation 및 p 유화
    1. 각 샘플에 17 μL 어댑터 결찰 혼합물을 준비하여 10 μL의 무염수, 5 μL의 10x 리가제 완충제(재료표),P1 어댑터 1 μL(재료표),DNA 리가제 1 μL(재료 표)을 첨가합니다. 5s에 대한 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 15 s에 대한 미니 원심 분리기에 회전, 단계 4.1.5에서 각 튜브에 aliquot.
    2. 샘플 시트에 따라 4.2.1 단계에서 각 튜브에 어댑터 1 μL (재료 표)을 추가하십시오 (보충파일: 어댑터 결찰용 샘플시트). 소용돌이및 3 s. 20 분 동안 RT (20−25 °C)에서 튜브를 인큐베이션하는 미니 원심 분리기에 잠시 회전합니다.
    3. 4.2.2단계에서 각 튜브에 75 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 정점으로 섞고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 이어서, 1.6.2단계부터 1.6.4단계까지 기재된 바와 같이 제품을 정제한다.
    4. 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 15 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다. 용출된 DNA를 함유한 모든 상상물질을 새로운 0.2 mL 8-튜브 스트립으로 옮김.
      참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 이 단계에서 정제된 DNA는 24시간 이하의 4°C에서 안정하다.
  3. 증폭 및 정제
    1. 슈퍼 믹스 (재료 표)와 프라이머 믹스 2.5 μL (재료표)를 추가하여 각 샘플에 대해 50 μL 증폭 마스터 믹스를 준비합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 미니 원심 분리기에 잠시 회전하고 단계 4.2.4에서 0.2 mL 8 튜브 스트립으로 aliquot.
    2. 30 s에 대 한 스트립 소용돌이 하 고 3 s에 대 한 미니 원심 분리기에 잠시 회전. 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에 스트립을 인큐베이션. 다음과 같은 설정으로 프로그램을 실행 : 72 °C에서 20 분; 95°C에서 5분; 95°C에서 15s, 62°C에서 15s, 70°C에서 1분 동안 10사이클; 70°C에서 5분; 4 °C에서 유지합니다.
    3. 각 제품을 4.3.2단계에서 새로운 1.5mL 튜브로 옮김. 각 튜브에 97.5 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 소용돌이로 섞어서 RT에서 5분 동안 배양합니다.
    4. 1.6.2 단계부터 1.6.4 단계까지 설명된 대로 제품을 정제한다.
    5. 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 25 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다.

5. DNA 라이브러리의 품질 관리 및 희석

  1. 제조자의 매뉴얼에 따라 형광계 분석에 의해 단계 4.3.5로부터 제조된 각 DNA 라이브러리를 2 μL을 원료로 사용하여 정량화하였다.
  2. DNA 라이브러리의 허용된 농도는 ≥ 0.5 ng/μL이고 양성 대조군(물자표)의농도는 ≤ 15 ng/μL이다. 양성 대조군 농도가 15 ng/μL에서 너무 많이 변하는 경우, 농도가 15 ng/μL에 가까워질 때까지 양성 대조군을 정량화한 것을 반복한다. 라이브러리의 농도가 0.5 ng/μL 미만이면 조각화(섹션 3)에서 다시 시작합니다.
    참고: DNA 라이브러리를 정량화하기 전에 양성 대조군 농도가 허용된 값에 도달하도록 합니다.
  3. 뉴클레아제없는 물을 추가하여 각 라이브러리를 100 pmol로 희석시다. 뉴클레아제 없는 물 n μL에 라이브러리 1 μL을 추가; 아래 방정식을 사용하여 n을 계산하십시오.
    figure-protocol-1
    여기서 Q는 형광계 분석및 C에 의해 측정된 각 라이브러리의 농도는 형광계 분석에 의해 측정된 양성 대조군농도이다.

6. 시퀀싱

  1. 시작하기 전에 각 샘플에 대해 1 M NaOH의 48 μL (20 % 초과)과 1 개의 뉴클레아제 프리 1.5 mL 튜브를 준비하십시오. RT에서 마스터 믹스 PCR 버퍼 (재료표)(2000 μL 부피)를해동하십시오.
  2. 라이브러리 풀링
    1. 소용돌이 는 단계 5.3에서 각 희석 라이브러리와 짧은 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 4x 회전 매번. 각 라이브러리의 5 μL을 가지고 뉴클레아제 없는 1.5 mL 튜브로 풀을 합니다. 혼합 라이브러리를 소용돌이시키고 3 초 동안 미니 원심 분리기를 잠시 돌입니다.
  3. 에멀젼 시스템을 이용한 에멀젼 PCR
    1. 2개의 새로운 회수 튜브(재료 표)에 150 μL의 브레이킹 용액을 추가합니다. 새로운 복구 튜브, 복구 라우터 및 증폭 플레이트를 설치합니다.
    2. 오일 병 (재료표)를3 번 뒤집어 섞는다. 오일 및 회수 용액(재료 표)이 적어도 2/3 이상이면 됩니다.
    3. 30s에 대한 마스터 믹스 PCR 버퍼를 소용돌이하고 3 s. 소용돌이 구 입자및 혼합 라이브러리를 1 분 동안 6.2.1 단계에서 미니 원심 분리기에서 잠시 회전하고 3 s에 대한 미니 원심 분리기에서 잠시 회전합니다.
    4. 2400 μL 결찰 혼합물을 172 μL의 뉴클레아제 없는 물, 단계 6.3.3, 120 μL의효소 혼합(재료 표)에서 혼합 라이브러리의 8 μL을 첨가하고, 2000 μL 마스터 믹스 PCR 버퍼를 함유하는 튜브에 구체 입자 100 μL을 첨가한다.
    5. 파이펫을 800 μL로 설정합니다. 1000P 파이펫을 사용하여 반응 필터에 200 μL의 반응 오일을 추가합니다.
    6. 프로그램 양성자: 이온 PI Hi-Q OT2 200키트를 선택한 다음 보조 버튼을 선택하여 모니터의 지침에 따라 장치가 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 그런 다음 다음을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
  4. 자동 농축 시스템에 의한 농축
    1. 에멀젼 PCR 프로그램이 완료되면 다음을 클릭한 다음 최종 회전을 클릭하여 10분 동안 회전합니다. 뚜껑열기를 클릭한 후 2개의 복구 튜브를 꺼냅니다.
    2. 각 튜브에 100 μL이 남아있을 때까지 2 개의 회수 튜브에서 상판을 버리고 그에 따라 라벨을 붙입니다. 용액을 잘 혼합하고 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.
    3. 각 회수 튜브에 200 μL의 뉴클레아제를 추가하고, 여러 번 파이펫팅하여 세척하고, 6.4.2 단계에서 모든 용액을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다. 세척 단계를 한 번 반복합니다.
    4. 200 μL의 뉴클레아제 없는 물을 회수 튜브 중 하나에 추가하고 여러 번 파이펫팅하여 세척합니다. 모든 용액을 다른 회수 튜브로 옮기고 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세척하십시오. 이어서, 모든 용액을 6.4.3단계에서 동일한 1.5 mL 튜브로 전송한다. 소용돌이 1.5 mL 튜브 30 s와 원심 분리기 8 분 에 대 한 15,500 x g.
      참고: 이 단계에서 에멀젼 PCR 제품의 최종 총 부피는 약 1200 μL이어야 합니다.
    5. 튜브에 상류를 버리고 에멀젼 PCR 제품의 20 μL을 유지합니다. 튜브에 재서스펜션 용액 80 μL(재료 표)을 추가합니다. 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요.
    6. 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 용액(재료 표)과 1 M NaOH의 40μL을 추가하여 각 칩에 320 μL 용융 용액을 준비합니다.
      참고: 1 M NaOH는 4°C에서 보관하거나 신선하게 제조해야 합니다. 사용 전에 소용돌이.
    7. 30초 동안 C1 비드(재료 표)를 함유한 튜브를 소용돌이. 새로운 1.5 mL 튜브에 C1 구슬 100 μL을 가져 가라. 1.5 mL 튜브를 RT에서 2 분 동안 자기 스탠드에 놓습니다. 구슬이 구슬을 방해하지 않고 정착 한 후 모든 상급을 폐기하십시오.
    8. 6.4.7 단계에서 튜브에세척 용액 C1 (재료 표)의 1 mL을 추가합니다. 30 s. RT에서 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 구슬이 구슬을 방해하지 않고 정착 한 후 모든 상급을 폐기하십시오. 비드 포획 용액 130 μL을 추가하여비드를 다시 일시 중단합니다(재료 표).
    9. 농축 시스템 (ES) 설정
      1. 샘플(100 μL 에멀젼 PCR 생성물)을 단계 6.4.5로부터, 세척된 비드(130 μL)를 단계 6.4.8로부터,ES 세척 용액(300 μL)(재료표)에서 8-튜브 스트립으로 6.4.6단계로 적재한다. 레이아웃 순서는 : 샘플 (튜브 1), 세척 비드 (튜브 2), ES 세척 용액 (튜브 3, 4, 5), 및 용융 액 (튜브 7). 튜브 6과 8을 비워 두십시오.
      2. 단계 6.4.9.1에서 8튜브 스트립을 ES에 놓습니다. 파이펫 팁과 새로운 0.2 mL 튜브를 설치하고 프로그램을 시작합니다.
        참고: 파이펫팅이 정상적으로 작동하는지 확인합니다.
    10. 농축이 완료된 후 구 입자를 세척합니다.
      1. 15,500 x g에서5 분 동안 단계 6.4.9.2에서 0.2 mL 튜브를 원심 분리기. 상급물을 버리고 농축 제품의 10 μL을 유지하십시오. 튜브에 200 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가합니다. 소용돌이로 섞으세요.
      2. 원심 분리기 0.2 mL 튜브에서 5 분 에서 15,500 x g. 상급물을 버리고 농축 제품의 10 μL을 유지하십시오. 튜브에 90 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가합니다. 소용돌이로 섞으세요.
  5. 템플릿 준비
    1. 소용돌이 긍정적 인 제어 및 짧은 회전. 100 μL 템플릿(6.4.10.2단계의 농축 생성물)에 5 μL의 포지티브 컨트롤을 추가합니다. 소용돌이 및 원심분리기 15,500 x g에서5 분. 상급을 버리고 템플릿의 10 μL을 유지하십시오.
    2. 6.5.1단계에서 템플릿 튜브에 시퀀싱 프라이머 20 μL(재료 표)과 어닐링 버퍼 15 μL(재료표)을추가합니다. 튜브를 소용돌이시키고 3 초 동안 미니 원심 분리기를 잠시 돌입니다.
    3. 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 단계 6.5.2에서 튜브를 배양합니다. 다음 설정으로 프로그램을 실행: 95 °C에서 2 분, 37 °C에서 2 분, 4 °C에서 유지.
    4. 6.5.3 단계에서 튜브에 10 μL의 로딩 버퍼(재료표)를 추가합니다. 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요.
  6. 시퀀서 초기화
    1. 질소 가스의 탱크 압력을 확인 (총 압력 ≥ 500 psi, 출력 압력 ≥ 10 psi, 최적의 20-30 psi). C1 및 C2 튜브(재료표)에 100 mL 탈이온수 (18.2 MΩ)를 상향식 및 시퀀서에 해당 C1 및 C2 위치에 설치합니다.
    2. W1(32 μL 의 1 M NaOH) 및 W3(W3 버퍼의40-50 mL [재료 표]) 솔루션을 준비합니다. 1920 mL의 탈이온수(18.2MΩ), 전체 W2 버퍼(재료 표)및 1M NaOH의 8-12 μL을 추가하고 4-8회 혼합하여 W2 용액을 준비합니다.
      참고: 수질은 지질학적으로 다르므로 필요에 따라 1M NaOH의 부피를 조정합니다. W2의 시작 pH는 5.9-6.1이며 조정 후 최적의 범위는 7.4-7.6입니다. 새로운 시약 튜브를 교체하고 설치하고 최근에 사용한 칩을 세척에 사용하십시오.
    3. 시퀀싱 보충 키트 (재료 표)에서 4개의 새로운 빈 튜브를 준비하십시오. 4개의 튜브를 dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP로 라벨을 부착하고, dGTP, dCTP, dATP또는 dTTP(재료 표)의 70 μL을 해당 튜브(즉, 70 μL dGTP)를 dGTP로 표시된 튜브에 추가합니다. 사용하기 전에 튜브를 소용돌이. 시퀀서 (재료 표)에 지정된 해당위치에 튜브를 설치합니다.
  7. 칩 워시
    1. 칩(재료표)을칩의 로딩 웰에 100 μL의 이소프로판올을 주입하여 한 번 세척한다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오.
    2. 칩의 로딩 웰에 100 μL의 뉴클레아제 없는 물을 주입하여 칩을 두 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오.
    3. 칩의 로딩 웰에 0.1 M NaOH의 100 μL을 주입하여 칩을 한 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오. RT에서 1분 동안 배양합니다.
    4. 칩의 로딩 웰에 100 μL의 뉴클레아제 없는 물을 주입하여 칩을 한 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오.
    5. 칩의 로딩 웰에 이소프로판올 100 μL을 주입하여 칩을 두 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오. 질소를 칩에 불어 건조시. 빛으로부터 멀리하십시오.
  8. 시료 로딩 및 시퀀싱
    1. 6.5.4 단계에서 55 μL 샘플을 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 샘플을 칩의 로딩 웰에 로드합니다.
      참고: 이 단계에서 사용되는 파이펫 팁과 0.2mL PCR 튜브를 보관하십시오.
    2. 칩을 칩 미니 원심분리기(재료표)에 놓습니다.
    3. 어닐링 버퍼 및 플러싱 용액을 위해 두 개의 새로운 1.5 mL 튜브를 준비합니다. 500 μL의 어닐링 버퍼와 500 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가하여 50% 어닐링 버퍼를 준비합니다. 어닐링 버퍼 500 μL과 100 % 2 프로판올 500 μL을 추가하여 플러싱 용액을 준비합니다.
    4. 2개의 새로운 1.5 mL 튜브를 준비하고 두 튜브에 49 μL의 50% 어닐링 버퍼 및1 μL의 발포 용액(재료 표)을 혼합하여 발포 혼합물을 준비한다.
    5. 파이펫을 100 μL로 설정합니다. 6.8.4 단계에서 두 튜브 중 하나에서 발포 혼합물로 공기를 피펫팅하여 기포를 만듭니다. > 120 μL의 거품을 만들고 눈에 띄는 기포가 보이지 않을 때까지 파이펫팅을 유지하십시오. 120 μL의 기포를 적재에 잘 로드합니다.
      참고: 눈에 띄는 거품이 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면 다시 시작합니다.
    6. 6.8.5단계에서 배수구에서 파이펫팅을 통해 적재물까지 과도하게 배출된 액체를 이송한다. 파이펫 버블을 하지 마십시오. 칩 미니 원심 분리기에 30s용 칩을 원심 분리합니다.
    7. 6.8.4단계에서 발포 혼합물을 함유하는 제2 튜브를 이용하여 6.8.5단계를 반복한다.
    8. 50% 어닐링 버퍼의 55 μL을 6.8.1단계에서 보관된 0.2 mL 튜브에 추가합니다. 6.8.1단계에서 보관된 파이펫 팁을 사용하여 파이펫을 위아래로 유지합니다. 모든 55 μL 어닐링 버퍼를 로딩웰에 로드합니다. 지정된 칩 미니 원심 분리기에 30s용 칩을 원심 분리합니다.
    9. 100 μL의 플러싱 용액을 칩 로딩에 잘 로드하고 배출된 액체를 잘 배출합니다. 이 로딩 단계를 한 번 반복합니다.
      참고 : 칩에 거품이있는 경우, 큰 거품에 의해 작은 거품을 추방하고 용액을 플러싱하여 플러시. 이는 플러싱 용액 100 μL을 파이펫팅하고 플러싱 솔루션 아래에 5 μL의 공기를 남기면 달성할 수 있습니다. 따라서, 105 μL을 칩에 파이펫팅할 때, 공기는 작은 기포를 배출할 수 있는 큰 거품을 형성할 것이고, 그 후, 큰 기포는 다음의 플러싱 용액에 의해 추방될 수 있다.
    10. 50% 어닐링 버퍼의 100 μL을 칩 로딩웰에 로드합니다. 이 로딩 단계를 총 3회 반복합니다.
    11. 시퀀싱 효소 6 μL을 50% 어닐링 버퍼의 60 μL에 새로운 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요. 이 혼합 용액의 65 μL을 칩 로딩에 잘 로드합니다. 거품을 피하기 위해 천천히 파이펫.
    12. 칩을 빛으로부터 멀리 하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
    13. 인큐베이션 후 즉시 칩을 시퀀서에 로드하고 화면에서 시퀀싱 시작을 클릭하여 시퀀싱을 시작합니다.
      참고: 시퀀싱 원시 데이터 및 품질 관리 파일은 데이터 분석을 위해 회사에 자동으로 업로드됩니다.

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결과

이 수정된 프로토콜에 기초하여, 반도체 염기서열 분석 플랫폼은 처음으로 PGT-A에 적용되었다. 우리는 분열 단계 배반및 배반포 단계 태아 둘 다에서 생검에 시험했습니다. 생검 된 세포는 DNA의 저하를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 WGA를 겪는 것이 좋습니다. 이전 연구는 상이한 WGA 방법의 성능을 비교하고 우리가 여기서 설명한 방법은 100 KB20의빈 크기에서 최고의 균일성을 가졌다는 것을 나타냈다. 균일성과 중앙값 절대 쌍차이(MAPD)21의성능을 고려하여, 이 WGA 방법은 반도체 시퀀서를 사용하여 PGT-A에 대해 선택되었다. 186개의 분열 단계 및 1135개의 배반포 단계 배아에 대한 회고적 통계 분석을 통해, 우리는 WGA 성공률이 블라스토미어 샘플에서 95.4%,배반포시스트 샘플에서 96.9%였다는 것을 관찰하였...

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토론

다른 시퀀싱 화학과는 달리, 여기에 설명된 시퀀서는 뉴클레오티드 검출을 위해 반도체를 사용합니다. 칩 자체는 양성자 프로그램의 2−4 시간 시퀀싱 시간을 가능하게 하는 폴리머라제 구동 염기 통합17에의해 수소 이온을 검출하는 전자 장치입니다. 게다가, 칩은 다른 시퀀서 공급자에 의한 유동 세포 시퀀싱 화학과 다른 하나의 표적 분자의 국소화를 허용하는 마이크로웰 칩이다. 이 프로토콜은 PGT-A의 적용에 최적화된 수정된 프로토콜입니다. 최적화는 오염의 기회를 줄이기 위해 초음파 대신 효소 방법에 의해 증폭 된 DNA의 단편화뿐만 아니라 크기 선택및 저렴한 비용으로 더 나은 성능을 위한 PCR 시스템을 포함한다. 또한 임상 환경에서는 변이체 호출을 위해 검증된 사내 파이프라인을 사용했습니다.

연습 중에 주의해야 할 중요한 단계가 있습니다. 정제를 위한 에탄올은 실험 전에 신선하게 준비되어야 하며, 에탄올의 고농도는 오염된 DNA의 세척을 불...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 연구는 홍콩의 일반 연구 기금 (참조 번호 14162417) 중국 국립 자연 과학 재단 (참조 번호 81860272), 광시 지방 과학 기술 재단의 주요 연구 계획에 의해 지원되었다 (참조 번호) AB16380219), 그리고 중국에서 중국 박사 후 과학 재단 보조금 (참조 번호 2018M630993).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PCR 튜브, 0.2 mLAxygenPCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ 및 Mg2+ freeThermoFisher10010023
1.0 M NaOH (1.0N) 용액SIGMA-ALDRICHS2567멜트오프 용액용. 분자 등급
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mLFisher Scientific13-698-791
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
ELGA PURELAB Flex 3 정수 시스템 또는
등가 18 MΩ 정제수 시스템		ThermoFisher4474524
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
PicoPLEX WGA 증폭 버퍼Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체될 수 있습니다.
PicoPLEX WGA 증폭 효소Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체할 수 있습니다.
Ion OneTouch 증폭 플레이트키트 : Ion OneTouch 2 소모품 (부품 번호 A26367). 시트의 확장 키트 구성 요소 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer 기기AgilentG2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)키트: Ion PI Hi? Q OT2 솔루션 200(부품 번호 A26429). 시트 5의 확장 키트 구성 요소
: Dynabeads MyOne, Streptavidin C1ThermoFisher65001
PicoPLEX WGA 세포 추출 버퍼, Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-00으로 대체할 수 있습니다.
PicoPLEX WGA 세포 추출 효소Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체할 수 있습니다.
Ion PI Chip Kit v3ThermoFisherA26771
이온 칩 미니fuge, 230 VThermoFisher4479673
이온 PI dATPThermoFisherA26772
이온 PI dCTPThermoFisherA26772
이온 PI dGTPThermoFisherA26772
이온 플러스 단편 라이브러리 키트ThermoFisher4471252
ThermoQIon Plus Fragment 라이브러리 키트
; 온도 건조 수조TAMARHB-T2-A
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
Ion PI dTTPThermoFisherA26772
Ion OneTouch 2 InstrumentThermoFisherINS1005527ThermoFisher 카탈로그 번호: 4474778.
Ion Plus Fragment 라이브러리 키트ThermoFisher4471252
Ion One Touch ESThermoFisher8441-22ThermoFisher 카탈로그 번호: 4469495. 시트 5 에탄올의 확장 키트 구성 요소
SIGMA-ALDRICH51976이것은 모든 브랜드의 분자 등급 절대 에탄올로 대체 할 수 있습니다.
PicoPLEX WGA 추출 효소 희석 완충액Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-01로 대체할 수 있습니다.
PicoPLEX WGA 추출 효소 희석 완충액Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-02로 대체할 수 있습니다.
Qubit 3.0 형광측정기ThermoFisherQ33216이 모델은 Qubit 4 형광측정기(카탈로그 번호: Q33226)로 대체되었습니다.
Qubit ds DNA HS 어세이 키트ThermoFisherM2002-02
Qubit 어세이 튜브ThermoFisherQ32856
이온 PI 발포 용액ThermoFisherA26772
라이브러리 바코드 색인BaseCare는 사내에서 준비한 색인입니다. 사용자는 ThermoFisher Ion Xpress 바코드 어댑터 키트(Cat. 번호 4474517)
Ion PI loading bufferThermoFisherA26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE bufferThermoFisher4389764
Agencour AMPure XP KitBeckman CoulterA63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack)ThermoFisher12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeMicro 1775002430
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Nuclease-free waterThermoFisherAM9922이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다.
PicoPLEX WGA 뉴클레아제가 없는 정제수Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템(카탈로그 번호: PR-40-415101-03)으로 대체할 수 있습니다.
이온 OneTouch 오일 병이온 PI 안녕? Q OT2 솔루션 200(부품 번호 A26429). Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit구성 요소 ThermoFisher 4471252
라이브러리 정량화 전에 Qubit을 보정하기 위해 자체에서 준비한 DNA 표준물질입니다.
PicoPLEX WGA 사전 증폭 버퍼Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템(카탈로그 번호: PR-40-415101-03)으로 대체할 수 있습니다.
PicoPLEX WGA 사전 증폭 효소Rubicon GenomicsR30050이 제품은 SurePlex DNA 증폭 시스템, 카탈로그 번호: PR-40-415101-03으로 대체할 수 있습니다.
라이브러리 증폭 프라이머 믹스ThermoFisher4471252시트 3의 확장 키트 구성 요소
이온 OneTouch 반응 필터시트 5의 확장 키트 구성 요소 복구
라우터시트 5의 확장 키트 구성 요소
튜브시트 5의 확장 키트 구성 요소
ISP Resuspension 솔루션
이온 양성자ThermoFisherDA8600이 모델은 ThermoFisher에서 Sun Yat-Sen University의 Da An Gene Co., LTD.에서 수입했으며 임상 적용을 위해 중국 식품의약국의 인증을 받았습니다. ThermoFisher의 카탈로그 번호는 4476610입니다.
이온 파이 안녕하세요? Q 염기서열분석 중합효소ThermoFisherA26772
Ion PI 염기서열분석 프라이머
서버LenovoT260
이온 PI 구 입자
플래티넘 PCR SuperMix 고충실도ThermoFisher4471252
Nalgene 25mm 주사기 필터ThermoFisher724-2045기공 크기 : 0.45&m. 특히 수성 유체 용.
이온 파이 안녕하세요? Q: W2 솔루션ThermoFisherA26772
이온 PI 1X, W3 솔루션, ThermoFisherA26772
이온 OneTouch 세척 솔루션, C1
The Ion PGM, Hi? Q 보기 염기서열분석 키트ThermoFisherA30044시트 2
이온 플러스 단편 라이브러리 키트구성 요소 ThermoFisher4471252확장 키트 구성 요소
(초기화당 1개의 염기서열분석 실행)ThermoFisherA26772시트 4
Ion PI Hi? Q OT2 200 키트ThermoFisherA26434확장 키트 구성 요소(시트 5)
, , &ndash 4471252 의 확장 키트 Sheet 3 double-strand DNA standard 의 확장 키트 구성 요소 복구 , , , 의 확장 키트 시트 3 Ion PI Hi-Q 염기서열분석 200 키트의

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