미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.
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이 논문에서
요약
초록
미토 콘 드리 아 기능을 최적의 건강 한 세포 활동, 특히 높은 에너지 요구 같은 신 경계와 근육에 있는 셀에에서 대 한 중요 하다. 일관 된,이 미토 콘 드 리아 기능 장애 신경 퇴행 성 질환 및 일반적으로 노화의 무수와 연결 되었습니다. 꼬마 선 충 elucidating 미토 콘 드 리아 기능의 많은 복잡 한에 대 한 강력한 모델 시스템 되었습니다. 미토 콘 드리 아 호흡 미토 콘 드리 아 기능의 강한 지시자 이다 고 최근에 개발 된 respirometers 세포에서 호흡을 측정 하는 최신의 플랫폼을 제공 합니다. 이 프로토콜, 라이브, 그대로 C. 선 충을 분석 하는 기술을 제공 합니다. 이 프로토콜 ~ 7 일의 기간에 걸쳐 (1) 성장 하 고 주입 하는 화합물의 C. 선 충, (2) 준비 및 프로브, (3) 약물 로드 및 카트리지 평형, 웜 분석 결과의 준비 (4) 수 분의 동기화에 대 한 단계를 포함 하 고 플레이트 및 실행, 분석 결과 (5) 후 실험 데이터 분석.
서론
아데노신 3 인산 염 (ATP), 세포 에너지의 주요 소스는 미토 콘 드리 아에 안 미토 콘 드리 아 막에 위치한 전자 전송 체인 (등)에서 효소에 의해 생산 됩니다. 어디 그것 decarboxylated 아 세 틸 보 효소 A (CoA)를 생산 하는 미토 콘 드리 아 모체로 pyruvate, 미토 콘 드리 아의 ATP 생산을 위해 활용 하는 주요 대사 산물 가져옵니다. 그 후, 아 세 틸 CoA 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)는 주요 전자 캐리어 분자의 세대의 결과로 구 연산 산 성 주기를 입력 합니다. NADH에서 전자는 등을 통해 산소에 전달 됩니다, 양성자 전기 화학 기온 변화도의 세대에서 막에 걸쳐 결과 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에 구축. 이러한 양성자 것입니다 다음 회전 그리고 ATP1 (그림 1)의 합성 ATP synthase의 양성자 기 공 통해 미토 콘 드리 아 모체로 다시이 전기 화학 기온 변화도 걸쳐 intermembrane 공간에서 흐른다.
미토 콘 드 리아 기능 에너지 생산에 국한 되지 않습니다 하지만 칼슘 항상성, 반응성 산소 종 (선생님), 청소 및 apoptosis, organisma....
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프로토콜
참고: 그림 2 는 전체 프로토콜의 개요 개요를 제공합니다.
1. 성장과 선 충 인구9,10 의 동기화
- 원하는 유전 배경의 L4 애벌레를 전송 (예: N2 [야생 유형] 및 sel 12 동물) 갓 대장균 (OP50)11의 잔디와 시드 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시 (제조 법에 대 한 표 1 참조)에. 두 개 이상의 100 m m 또는 3 개의 60 m m 플레이트를 사용 하 여 각 변형에 대 한. 3-4 일 또는 격판덮개는 계란과 벗 벌레의 큰 수로 집중 될 때까지 적절 한 성장 온도 (15-25 ° C) 사이 벌레를 품 어.
- 계란과 M9 버퍼의 약 6 mL를 사용 하 여 격판덮개 떨어져 벌레 세척 (제조 법에 대 한 표 1 참조) 선 충 및 전송의 100 mm 접시 당 그들 각 변형에 대 한 개별 15ml 원심 분리기 튜브로 파스퇴르 펫을 유리. 6,180 x g와 M9 버퍼, 단지 동물과 계란 펠 릿을 유지 밖으로 aspir....
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결과
프로토콜을 사용 하 여 여기, OCR 야생 유형 동물 및 3 명의 다른 sel 12 돌연변이 종자 결정의 설명. sel-12 presenilin17의 선 충 C. ortholog을 인코딩합니다. 인간의 presenilin에 돌연변이 가족 Alzheimer의 질병18의 개발과 관련 된 가장 일반적인 유전 착오. 우리의 연구는 야생 타입 동물3에 비해 돌연변이 동물 sel- 12에서 상승 된 미토 콘 드리 아 칼슘 수준을 보여줬다. Sel 12 돌연변이 및 야생 유형 동물에 OCR sel 12 돌연변이의 효과 검사 측정 되었다 칼슘 dysregulation 변경 된 미토 콘 드리 아 기능3,.......
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토론
미토 콘 드리 아 호흡은 통찰력 있는 미토 콘 드 리아 기능; 따라서, 생체 외에서 또는 vivo에서 생물 학적 시스템에 산소 소비 속도 측정할 수 있는 매우 귀중 한입니다. Respirometers 산소 또는 산소 압력 전기 전류 비례의 생성에 의존 하는 amperometric 산소 센서를 통해 침묵 얻을 포 르 피 린 기반 형광체를 사용 하 여 산소 레벨을 감지 한다. 클라크 전극 후자의 범주에 폭포와 C. 선 충에 호흡을 분석 하는 동안 특히 문학, 광범위 하 게 사용 되어 있다. 그러나, 큰 샘플 크기와 무 능력 한 번에 하나 이상의 샘플을 평가 대 한 필요는 amperometric 산소 센서 비효율적.
이 프로토콜 미토 콘 드리 아, 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 영향을 줄 수 있는 과정을, 따라서, OCR을 분리 하지 않고, 그대로 C. 선 충 에서 측정 OCR에 간단한 가이드를 제공 합니다. 그 동물 전시 다양 한 생활 단계를 통.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 그의 실험실에서 해 마 XFp를 설정에 대 한 박사 케빈 Bittman 인정 하 고 싶습니다. 국립 보건원 부여 GM088213이이 작업을 지원 합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100 mm, 60 mm 페트리 접시 | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL 원심분리기 튜브 | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL 원추형 튜브 | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm 커버슬립 | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto 펩톤 | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto 트립톤 | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto 효모 추출물 | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2· 2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| 콜레스테롤 | Fisher Scientific | C314-500 | |
| 탈이온수(dH2O) | |||
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 (MgSO4· 7H2O) | 피셔 사이언 | BP213-1 | |
| 인산칼륨 이염기성(K2HPO4) | 피셔 사이언티픽 | BP363-1 | |
| 인산칼륨 일염기성(KH2PO4) | 피셔 사이언티픽 | P285-500 | |
| 염화나트륨 | 피셔 사이언티픽 | BP358-10 | |
| 수산화나트륨(NaOH) | 피셔 사이언티픽 | BP359-500 | |
| 인산나트륨 이염기성 무수(Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp 분석기 | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| 아지드화 나트륨 | 시그마-알드리치 | S2002 |
참고문헌
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
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재인쇄 및 허가
