색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

요약

이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법 설립

초록

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 간결한와 진 핵 세포에서 표현 하는 일반적인 효소 이다. 그것은 인산 염 monoesters 기본 pH에 많은 분자에서의 가수분해를 catalyzes 고 인산 대사에 필수적인 역할을 한다. 인간에서는, 진 핵 ALP cholestasis 구루병 등 다양 한 질병을 진단에 가장 자주 사용된 효소 신호 중 하나입니다. 미 에 균, ALP 세포 막;에 감지 되 그것은 또한 뿐만 아니라 분 비 양식으로 표현 된다. 그러나, 약간 biofilm 형성에서 기능에 대 한 알려져 있다.

이 원고의 목적은 단백질 격리를 필요로 하지 않는 미 균 biofilm에서 ALP 활동 측정을 신속 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과 개발 하는 것입니다. P-nitrophenyl 인산 염 (pNPP)를 사용 하 여 기판으로, 96-잘 조직 배양 배지에서 형성 된 미 균 biofilm에서 ALP 활동을 측정 했습니다. 활동은 405 nm 흡 광도 측정 성 반응 제품의 형성을 기반으로 합니다. 96 잘 조직 문화 접시 방법의 높은 처리량 자연 ALP 활동 분석에 대 한 과민 하 고 재현할 수 있는 방법을 제공합니다. 같은 실험 설정 또한 biofilm 형성에 관련 된 다른 세포 외 분자 마커 측정을 확장할 수 있습니다.

서론

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)는 모두 간결한 및 진 핵 세포¹편 표현 됩니다. 그것은 다른 분자 뉴클레오티드, 단백질, 알 카 로이드, 인산 에스테 르, 인산의 anhydrides 등에서 monophosphate의 가수분해를 촉매 수 있습니다. 인간에서는, 진 핵 ALP는 간, 뼈, 내장과 태 반²를 포함 하 여 많은 조직에 존재. 그것은 단백질 인 산화, 세포 성장, apoptosis, 줄기 세포 프로세스 뿐만 아니라 정상적인 골격 강화에 중요 한 역할을 한다. 진 핵 ALP는 또한 뼈, 간, 그리고 다른 조직/장기 상승 하는 때에 질병의 존재에 대 한 주요 혈 청 지표^3,4.

간결한 ALP 토양⁸에서 대장균⁵, S. 구 균^6,7 및 몇 가지 일반적인 제일 위 박테리아 등 세균성 세포의 다양 한에서 검색 되었습니다. 세균....

프로토콜

1. 매체 준비

1. 1 L Tryptic 간장 국물 (TSB)의 준비:로 1 L 증류수, 카 제인, 콩 식사, 3 g의 염화 나트륨, 포도 당의 2.5 g와 dipotassium 인산 염의 2.5 g의 papaic 다이제스트의 5 g의 췌 장 소화의 15 g 추가. 사용 하기 전에 소독.
2. TSB, 1 리터에 한 천 15 g을 추가 하는 대 한 Tryptic 간장 Agar (TSA), 오토 클레이 브. 다음 그것은 실내 온도 아래로 멋진 보자. 그런 다음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m) 당 20 mL의 비율로 붓는 다.
3. Biofilm 문화 매체: 압력가 TSB의 1 리터에 포도의 10 g를 추가. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 여과 하 여 소독.

2. 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 Biofilm 형성

참고: S. 구 균 biofilm는 앞에서 설명한^6,21으로 교양 이다.

1. TSB의 10 mL에 TSA에서 S. 구 균<....

결과

그림 1 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 의 biofilm 문화에서 ALP 활동의 대표적인 결과 보여 줍니다. 상업적으로 사용 가능한 pNPP 솔루션의 75 μ 각각 잘 하 고 실 온에서 incubated에 추가 되었습니다. 서로 다른 시간에 대 한 부 화 후 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분, 각각) 75 μ 5 M NaOH의 반응을 중지에 추가 되었습니다. 제품은 다음 405에서 96 잘 접시 리더에서 측정 되었다 nm. 각 시간 점에 단일 96 잘 접시에서 세 쌍둥이에 반복 되었다 그리고 전체 실험 3 개별 96 잘 접시에 반복 되었다.

토론

우리의 분석 결과 우리 ALP 기판으로 pNPP를 사용합니다. ELISA를 위한 작업 솔루션 이며 아무 희석이 필요 하다. 높은 산에 의해 가수분해, 후 노란색 제품 개발 하 고 405에서 측정 될 수 있다 nm. 효소 반응의 끝에, 우리는 간단히 96 잘 접시를 centrifuged 하 고 신선한 96 잘 접시 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 하는 상쾌한 전송. 우리는이 여분의 원심 분리 단계는 중요 한, 일관성 405에서 흡 광도의 증가 때문에 발견 nm, 아마도 효소 반응 동안 발생 가능한 정지 셀을 제거 하 여.

Biofilm 형성에 대 한 우리 보고^6,21로 숙박 문화에 대 한 1: 100 (v/v) 희석의 200 μ 사용합니다. 이것은 다른 희석 (데이터 표시 되지 않음)에 비해 biofilm 형성 S. 구 균 에 대 한 최적의 희석 이다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf 원심분리기	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH 펠릿	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)에 자주 사용되는 pNPP 액체 기질의 일반적인 농도는 10 - 50mM 사이입니다. 여기에 사용된 것과 같이 대부분의 즉시 사용 가능한 pNPP 액체 기질과 유사하게, 정확한 pNPP 농도는 이의 독점적 특성으로 인해 공개되지 않습니다.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
플레이트 리더	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
트립틱 소이 한천            15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
트립틱 소이 국물:          g/L 카제인의 췌장 소화제............ 15.0 간장 식사의 파파익 다이제스트......... 5.00 염화나트륨.............................. 3.00 포도당........................................   2.50 인산이칼륨.................. 2.50	VWR	90006-098
96 우물 조직 배양 플레이트	BD	6902D09	U자형 바닥