효소 활동의 열 안정성은 쉽게 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 측정 됩니다. 대부분 단백질 안정성 분석 실험은 현재 측정 단백질 전개, 사용 하지만 효소 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. ITC의 효소 활동의 안정성에 효소 수정 효과의 직접 측정을 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이 작품에는 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 효소 활동의 안정성을 측정 하기 위한 새로운 방법을 보여 줍니다. 최대 열 속도 효소 솔루션으로 기판 솔루션의 단일 주사 효소 활동을 연관 후 관찰. 시간이 지남에 따라 동일한 효소 솔루션으로 기판의 여러 주사 효소 활동의 손실을 보여줍니다. 분석 결과, 아주 약간의 인사 시간을 요구 하는 자치 이며 대부분의 미디어와 효소에 적용 됩니다.
서론
효소는 단백질 catalyzing 다양 한 유기 반응의 수 있습니다. 중립 pH 가혹한 용 매를 사용 하 여 피할 근처에서 수성 해결책에서 대부분 효소 기능. 그들의 높은 선택도 때문에 효소 촉매 반응 적은 생산 (일부 경우에 아무 부산물) 산 및 기초1등 선택적 비 촉매 보다 부산물. 이것은 특히 관련 식품 제조 최종 제품 인간의 소비를 위한 안전은 모든 화학 반응을 수행 해야 합니다 어디 에입니다. 현재, 효소는 높은 당 옥수수 시럽2, 치즈3, 맥주4, 유 당-무료 우유5및 다른 중요 한 식품을 생산 하는 데 사용 됩니다. 이 종이 식품 산업에서 효소 사용에 초점을 맞추고, 하는 녹색 화학 및 의약품 합성에 포함 하는 효소에 대 한 다른 많은 사용이 있습니다.
효소의 유틸리티는 효소의 3 차원 구조를 유지에 따라 효소 활동의 안정성에 의해 제한 됩니다. 효소 구조 수정 PEGylation6, 동원 정지 고체 지원7,8, 유전 수정 및 공식에 의해 안정 될 수 있다. 현재, 효소 안정성은 차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC)에 의해 일반적으로 측정 하 고 끝점 효소 활동 분석 실험9. DSC 측정 온도는 효소 펼쳐져; 더 높은 온도, 더 안정적인 구조. 그러나, 활동의 손실 효소 또는 효소10내 도메인을 전개 하는 데 필요한 보다 낮은 온도에서 자주 발생 합니다. 따라서, DSC 효소 수정 효소 활동의 안정성을 증가 여부를 확인 하려면 충분 하지 않습니다. 끝점 효소 분석 실험 보통 집중 시간, 여러 샘플을 필요로 하 고 종종 매우 색 또는 불투명 솔루션 또는 정지에 적용 되지 않습니다 하는 결합 된 색도계 반응을 포함.
이 작품 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 효소 활동의 안정성의 직접 측정 하는 방법을 보여 줍니다. ITC는 열 또는 반응의 과정에서 흡수의 속도 측정 합니다. 이후 거의 모든 반응 생성 하거나 열을 흡수, ITC는 우유와 같은 불투명 한 미디어에 반응 결합 반응을 하거나 발생 하지 않는 등 대부분 효소 촉매 반응에 대 한 사용할 수 있습니다. ITC는 많은 종류의 반응, 화학 운동 매개 변수를 측정 하기 위해 많은 수십 년 동안 사용 되었습니다 하지만 여기에 제시 된 프로토콜 ITC를 사용 하 여 효소 촉매 반응의 피크 열 속도 측정에 초점을 맞추고 효소 활동 선형 함을 보여 줍니다. 최대 열 속도와 상관 된다. ITC 피크 열 속도의 측정은 주로 자율 고 아주 작은 인사 시간 설정 및 분석 필요로.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 샘플 준비
-
pH 4.6에서 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼의 1000 mL
- 졸업 하는 1000 mL 비 커에 증류수 800 mL를 측정 합니다.
- 무수 나트륨 아세테이트의 8.2 g의 무게와 비 커에 추가.
- 비 커 저 어 접시에, 비 커로 저 어 막대를 배치, 저 어 접시에 돌려 놓고 완전히 녹아 때까지 저 어.
- 무수 나트륨 아세테이트는 완전히 해산, 보정 된 pH 미터를 가진 해결책의 pH를 측정 합니다.
- 원하는 pH 4.6를 1 M HCl 이나 NaOH 적절 하 게 추가 합니다.
- 때까지 총 볼륨은 1000 mL 증류수를 추가 합니다.
- 사용까지 실내 온도에 상점.
-
효소 솔루션
- 효소 졸업 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.6 15 ml에서의 첫 번째 측정 8 mL에 의해 10-30 mg/mL 범위 내에서 솔루션 실린더의 10 mL를 준비 합니다.
- 효소와 함께 15 mL 원뿔 튜브에 버퍼 솔루션을 추가 하 고 효소 해산 했다 때까지 적극적으로 악수.
- 총 볼륨은 10 mL 때까지 더 많은 버퍼 솔루션을 추가 합니다.
- 사용 될 때까지 4 ° C에서 효소 솔루션을 저장 합니다.
-
기판 솔루션
- 300-600 m m 범위 내 기판 솔루션을 준비, 기판 그램에 원하는 농도 확인 하는 데 필요한 금액을 계산 합니다.
- 기판에 밖으로 무게와 100 mL 유리 비 커에 배치
- 졸업 25 mL 실린더를 사용 하 여 버퍼 솔루션의 20 mL를 측정 하 고 유리 비 커에 추가.
- 저 어 접시에 비 커를 놓고 비 커에 자석 저 어 막대를 배치 합니다. 더위를 켜고 교 반 속도 적절 하 게 조정.
- 기판은 해산 될 때까지 계속 저 어 수 있습니다.
- 50 mL 원뿔 튜브로 기판 솔루션을 부 어 하 고 총 볼륨은 45 mL 때까지 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 pH 4.6을 추가 합니다. 흔들어 섞는다.
- 사용 될 때까지 실 온에서 기판 솔루션을 저장 합니다.
2. 실험 수행
- ITC는 악기를 준비
- 참조 셀은 350 µ L의 증류수에 대 한 로드를 확인 합니다. 샘플 셀에 효소를 로드 하기 전에 샘플 셀 청소 되었는지 확인 합니다.
- 프로토콜-채우기 로드 주사기 2% 청소 솔루션 (자료 테이블)의 500 µ L와 함께 청소, 신중 하 게 샘플 셀에 바늘을 삽입, 셀 채우기 및 천천히 같은 주사기를 사용 하 여 액체를 제거. 비 커에 액체를 폐기 합니다. 70% 에탄올과 2% 청소 솔루션 (재료의 테이블)을이 두 번 세 번 반복 하 고 증류수로 10 번을 씻어.
- 효소 솔루션의 450 µ L 로드 주사기를 채우십시오, 신중 하 게 샘플 셀의 하단에 모든 방법을 바늘을 삽입 하 고 천천히 기포의 형성을 방지 하기 위해 100 µ L 라인 아래로 플런저를 누르십시오.
- 물으로 바늘 끝을 배치 다음 천천히 차지는 주사기로 물 다음 폐기물 용기에 물을 분배 하 여 증류수로 50 µ L 적정 주사기 세 번을 씻어.
- 세 번 기판 솔루션 rinsing 하 여 잔여 물을 제거 합니다.
- 주사기는 어떤 공기 거품 없이 가득 될 때까지 솔루션을 그려서 기판 솔루션 적정 주사기를 채우십시오.
- 여전히 기판 솔루션에에서 주사기 플런저를 제거 하 고 약 2 µ L 주사기의 상단을 입력 하는 플런저를 다시 공기의 허용.
- ITC의 buret 핸들을 제거, buret 핸들 안에 주사기를 놓고 나사를 꽉 때까지.
- 보풀 없는 조직으로 활동가의 끝을 닦아 다음 신중 하 게 buret 핸들 ITC에 놓고 장소에 잠금.
3입니다. 설정 ITCrun
- 컴퓨터에서 ITCrun 을 열고 설정을 클릭 합니다.
- 교 반 속도 클릭 하 고 350 RPM으로 설정. 주사기 크기 (µ L)을 확인 하 고 그것은 50 µ L에 확인.
- 온도 설정 하 고 업데이트를 누릅니다. 이 단계를 수행 하는 것이 좋습니다 ITC를 준비 하기 전에 적어도 1 시간. 열 또는 필요에 따라 진정 악기에 대 한 충분 한 시간 수 있습니다.
- 실험 설정에 대 한 증분 적정을 선택 합니다.
- 주사를 설정 하려면 삽입 을 클릭 합니다. 5400 주입 간격 조정 s, 4 및 4 주입 수 주입 볼륨 (µ L). 설정을 확인 하려면 확인 을 누릅니다.
- 재래식 상자에서 자동 equilibrate 및 큰 예상 열을선택 합니다. (예상된가 열 작은 경우에, 사람은 예상된 열 아래 작은 선정할 수 있다; 그러나,이 평형 시간을 증가할 것 이다.)
- 300으로 초기 기준선 설정 s.
- 실행된, 클릭 시작 하려면 시작 감동 요금 옆에 있는 기호 하 고 시작 렌치 기호 옆에 위치를 클릭 합니다.
- 파일을 저장 하 고 실행 하려면 악기를 허용.
4. 데이터 분석
- NanoAnalyze에서 파일을 엽니다. 데이터 를 클릭 하 고 데이터 열을 선택 합니다.
- 모든 데이터를 선택, 복사 하 고 Microsoft Excel로 데이터를 붙여 넣습니다.
- 300에서 필요한 값을 추가 하 여 0 기준선을 조정 하기 위해 s 0. 이 수정 열 속도 값의 전체 열에 적용 됩니다.
- 방정식을 사용 하 여 각 주입에 대 한 열 속도의 최소 또는 최대 값 찾기: =MIN(cell:cell) 또는 MAX(cell:cell). 각 데이터 요소는 각 주입에 효소의 피크 효소 활동을 나타냅니다.
- 값은 적정 하는 동안 발생 한 시간에 대 한 최소 또는 최대 값의 그래프를 플롯 합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 1 및 그림 5 는 대표적인 결과 데이터 두 효소 lactase 및 당화를에서 보여줍니다. Lactase 및 당화 endothermically와 exothermically, 각각 두 개의 단으로는 당의 가수분해 촉매. 두 효소 반응 효소의 채도 배제 하는 농도에서 실행 되었습니다.
Lactase 데이터 ITC 데이터를 사용 하 여 효소 안정성을 추정 하는 방법을 보여 줍니다. 600 m m 유 당 (그림 1)의 4 개의 순차적 4 µ L 주사 20 mg/mL lactase로 적정 했다. 5400의 간격 각 주입 사이 s, 적용 하 고 각 주입 하기 전에 초기 기준선 돌아갈 충분 한 시간 수 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜 25 ° C와 35 ° C, 45 ° C, 55 ° c.에서 수행 되었다 또한, 유 당 600...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 설명 된 ITC 효소 안정성 분석 결과의 주요 이점은 자동화 이다. 일단 모든 적절 한 버퍼 및 솔루션은, 각 분석 결과 대 한 설정 시간 분석 결과 하 고 사람에 대 한 약 15 분입니다. 반면, 당화 및 lactase의 활동에 대 한 기존의 분석 하 고 분석 결과의 지속적인 참여와 함께 약 2 시간을 요구 하 고 많은 효소 활동 분석 실험을 상당히 더 많은 시간. 이전 발행물에서 우리는 당화 활동11에 대 한 더 전통적인 spectrophotrometric 방법에 ITC 메서드에서 데이터를 비교 하는 방법을 증명 하고있다.
ITC는 분석 결과의 또 다른 장점은 거의 모든 효소12의 적용입니다. 따라서, 특정 조건에서 다른 효소의 안정성 테스트 여러 다른 분석 실험 설정이 필요 하지 않습니다. 또한, ITC 분석 결과 새로운 효소 또는 적합 한 색도계 분석 결과 효소의 활동의 안정성을 ...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| a-락토오스 | 피셔 사이언티픽 | 알 수 없음 (너무 오래된) | 500g |
| 나트륨 아세테이트, 무수 99% 분 | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| 락타제 | MP Bio | 100780 | 5g |
| 하이드로콜릭 애씨드 솔루션, 1N | 피셔 사이언티픽 | SA48-500 | 500mL |
| 벤치탑 미터- pH | VWR | 89231-622 | |
| 에탄올 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1갤런 |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L(세척액) |
참고문헌
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
