면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

요약

여기에 제시된 면역성 화학적 특성화 및 오렉스신 펩티드, 오렉스신 수용체, 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장내 엔도칸나비노이드 수용체의 국소화를 위한 프로토콜이 제시되어 있다. 면역 페릭시다아제 및 이중 면역 형광 방법.

초록

면역 조직 화학 (IHC)는 표지된 항체를 가진 조직 단면도에 있는 표적 항원의 검출에서 관련시키는 높게 과민하고 특정 기술입니다. 최적의 특정 신호를 얻기 위해 각 단계의 최적화가 중요한 다단계 프로세스입니다. IHC를 통해 특정 바이오마커의 분포와 국소화를 감지하여 진화적 보존에 대한 정보를 공개할 수 있습니다. 더욱이, IHC는 비만과 같은 병리학적인 조건에서 바이오마커의 발현 및 분포 변화의 이해를 가능하게 한다. IHC, 주로 면역 형광 기술, 계통 유전학적으로 보존 된 분자의 조직 및 분포를 검출하기 위해 성인 얼룩말에서 사용할 수 있지만, 표준 IHC 프로토콜은 estasbled되지 않습니다. 오렉스신과 엔도칸나비노이드는 음식 섭취와 비만 병리의 통제에 관여하는 두 개의 고도로 보존된 시스템입니다. 여기에 보고된 프로토콜은 오덱신 펩티드(OXA), 오렉스신 수용체(OX-2R), 카나비노이드 수용체(CB1R) 국소화 및 정상 및 식이 유발 비만(DIO) 성인 제브라피시 모델의 장및 뇌분포에 대한 정보를 얻기 위해 사용된다. 또한 면역페록시다아제 및 이중 면역형광에 대한 방법뿐만 아니라 시약의 제제, 고정, 파라핀-임베딩, 제브라피시 조직의 극저온 보호 및 내인성 활성 차단 단계 및 배경을 위한 제제 역염색. 매개 변수의 전체 세트는 우리가 면역 형광이 OXs, OX-2R 및 CB1R 분포, 현지화 및 성인 얼룩말에서 표현의 보존의 이해에 도움이 될 수있는 방법을 보여 준 이전 IHC 실험에서 얻은 조직. 고도로 구체적인 신호 강도를 가진 결과 이미지는 제브라피쉬가 특정 바이오마커의 분포, 국소화 및 진화적 보존에 적합한 동물 모델이라는 것을 확인했습니다. 생리적 및 병리학적 조건. 여기에 제시된 프로토콜은 성인 얼룩말어의 IHC 실험에 권장됩니다.

서론

면역조직화학(IHC)은 항원-항체 상호작용^1,2에의해 세포 또는 조직 성분(antigens)을 식별하는 데 사용되는 잘 확립된 고전 기술이다. 조직 내의 표적 생체분자의 국소화 및 분포를 식별하는데 사용될 수 있다. IHC는 조직 섹션에서 항원을 검출하기 위해 면역 학적 및 화학 반응을 사용³. 항원-항체 상호작용의 가시화에 사용되는 주요 마커는 형광 염료(immuno형광) 및 효소 기질 색 반응(면역페록시다아제)을 포함하며,둘 다 항체에 공액화된다 4. 현미경 관찰을 사용하여 표지 된 조직의 국소화를 결정할 수 있으며, 이는 조직 내의 표적 항원의 국소화에 약 대응합니다.

단백질을 검출하기 위해 형광 또는 발색 반응을 위해 존재하는 두 가지 방법이 있습니다 : 특정 1 차 항체가 직접 표지되는 직접 검출 방법; 및 간접 검출 방법은, 1차 항체가 비공화되고 이차 항체가 라벨5,^6,7을운반하는 동안.^....

프로토콜

1. 면역페록시다아제 프로토콜

참고 : 제브라피쉬는 오미드 사파리 교수 (수산학과, 천연 자원 및 환경 학부, 마슈하드, 마슈하드, 이란 의 페르도우시 대학)에 의해 얻어졌다¹⁰.

1. 조직 해부
   1. 얼음물에 침수하여 제브라피시를 희생 (5 부분 얼음 / 1 부분 물, 4 ° C); 저산소증에 의한 죽음을 보장하기 위해 모든 운동이 중단 될 때까지 그들을 둡니다.
   2. 다음과 같은 해부 방법으로 창자와 뇌를 신속하게 제거하십시오.
      1. 종이 타월에 물고기를 건조하고 해부 매트에 처지게 배치, 눈 소켓의 복부 부분과 꼬리의 육체 부분을 차단.
      2. 장의 경우 : 피부를 잘라 조심스럽게 내부 장기가 볼 때까지 물고기의 측면에서 피부와 기본 근육을 제거합니다. 몸을 뻗어 몸 구멍에서 창자를 제거합니다.
      3. 뇌의 경우: 면도날로 머리를 제거합니다. 집게로 두개골의 복부 쪽에서 부드러운 조직을 제거하십시오. 두개골을 열고 뇌의 복부 쪽에서 뼈를 제거합니다. 뇌의 등쪽에서 피부와 두개골 뼈를 제거합니다. 뇌를 제거합니다.

결과

면역페록시다아제 염색에 대한 대표적인 데이터는 도 1 및 도 2에도시되어 있다. 성인 제브라피시의 장에서 OX-A 및 OX-2R 분포의 면역조직화학적 분석은 DIO 제브라피시의 장세포에서의 OX-A 및 OX-2R의 상이한 국소화 부위 및 이들의 발현 증가를 보여주었다. OX-A에 대한 강렬한 갈색 염색은 내측 및 전방 장의 세포에서 관찰되었다 (도1A,A 1). OX-A의 면역 발현은 다른 창자 구성에서 명확한 신호를 주었고, 내측 장으로 전방에서 감소하였다 (그림1B,B 1). 음극 대조군을 배경에 대한 참조로서 사용하였고 OX-A신호의 특이성을 확인하였다(도 1E). 염색체 DAB에 장기간 노출되면 배경 강도의 증가가 발생.......

토론

샘플 준비

시료 전형은 IHC의 첫 번째 중요한 단계입니다. 신뢰할 수 있는 프로토콜을 통해 세포 형태, 조직 구조 및 항원성을 유지보수할 수 있습니다. 이 단계는 올바른 조직 수집, 고정및 절편^22,23이필요합니다. 고정의 목적은 조직을 보존하고 조직 효소 또는 미생물의 작용을 감소시키는 것입니다. 특히, 고정 단계는 세포 성분과 생체 분자를 보존하고, 세포 성분(예: 항원 및 효소)의 자가 분해 및 이동을 방지하고, 다음 절차의 비역적 효과에 대해 세포 물질을 안정화시키고, 4,^7,24.

절편되기 전에, 조직은 파라.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티 CB1	Abcam	ab23703
안티 OX-2R	산타 크루즈	sc-8074
안티 OXA	산타 크루즈	sc8070
아쿠아 텍스	머크	1,085,620,050
바이오 티닐화 토끼 안티 염소	Vector Lab	BA-5000
구연산	시그마 Aldrich	251275
컨 포칼 현미경	니콘	니콘 이클립스 Ti2
저온 유지 장치	라이카 바이오 시스템	CM3050S
DAPI	시그마 알드리치	32670
디지털 카메라	라이카 바이오 시스템	DFC320
컨 포칼 현미경 용 디지털 카메라	니콘	DS-Qi2
당나귀 안티 염소 알렉사 플루or 488 활용 2 차 항체와 관련상품	Thermo Fisher	A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary 항체	Thermo Fisher	A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary 항체	Thermo Fisher	A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary 항체	Thermo Fisher	A21207
Ethanol 절대	VWR	20,821,330
냉동 단면 화합물	Leica Biosystem	FSC 22 냉동 단면 매체
H2O2	Sigma Aldrich	31642
HCl	VWR	20,252,290
ImmPACT DAB	Vector lab	SK4105
현미경	Leica Biosystem	DMI6000
마이크로톰	라이카 바이오시스템	RM2125RT
Na2HPO4	시그마 알드리치	S9763
NaCl	시그마 알드리치	S7653
NaH2PO4H2O	시그마 알드리치	S9638
NaOH	시그마 알드리치	S8045
노멀 당나귀 세럼	시그마 알드리치	D9663
노멀 래빗 세럼	Vector lab	S-5000
파라핀 왁스	Carlo Erba	46793801
Paraphormaldeyde	Sigma Aldrich	P6148
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
Triton X-100	Fluka Analytical	93420
Trizma	Sigma Aldrich	T1503
VectaStain Elite ABC Kit	Vector lab	PK6100
크실렌 퓨어	Carlo Erba	392603