방법 논문

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

DOI:

10.3791/59321

⸱

2019년 5월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 여기에서 인간 유도 만능 줄기 세포 로부터 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런을 얻는 방법을 설명 한다 (iPSCs). 운동 뉴런으로의 직접 전환은 전사 인자의 대체 모듈, 즉 Ngn2, Isl1 및 Lhx3 (NIL) 또는 Ngn2, Isl1 및 Phox2a (닙)의 자 궁 외 발현에 의해 얻어진 다. NIL과 닙은 각각 척추와 두개골 운동 신경 정체성을 지정 합니다. 우리의 프로토콜은 NIL 또는 닙이 piggyBac 전치 벡터를 통해 게놈에 안정적으로 통합 되는 수정 된 iPSC 라인의 생성으로 시작 합니다. 트랜스 유전자의 발현은 이어서 독 시 사이 클린에 의해 유도 되 고, 5 일 후에, iPSCs를 MN 조상로 전환 한다. 이후 성숙, 7 일 동안, 척추 또는 두개골 MNs의 동종 인구에 이르게. 우리의 방법은 이전 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 보유: 그것은 매우 신속 하 고 단순화; 그것은 바이러스 감염이 나 추가 MN 격리를 필요로 하지 않습니다; 그것은 활동 전위의 기차를 발사 하는 능력에 의해 입증 된 대로, 성숙의 놀라운 학위와 다른 MN 하위 인구 (척추와 두개골)를 생성 할 수 있습니다. 더욱이, 다 수의 모터 뉴런은 혼합 된 집단 으로부터 정제 없이 얻어질 수 있다. iPSC 유래 척추 및 두개골 모터 뉴런은 운동 신경의 근 위축 성 측 삭 경화 증 및 기타 신경 변성 질환의 시험관 내 모델링에 사용 될 수 있다. 균질 한 운동 뉴런 집단은 세포 형 특정 약물 스크리닝을 위한 중요 한 자원을 나타낼 수 있다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

운동 뉴런 (MN) 변성은 근 위축 성 측 삭 경화 증 (ALS)과 척추 근육 위축 (SMA)과 같은 인간의 질병에서 원인 역할을 한다. 인간 MN의 복잡성을 탈환 하는 적절 한 시험관 내 셀 모델 시스템을 확립 하는 것은 새로운 치료 접근법의 개발을 향한 중요 한 단계 이다. 유도 만능 줄기 세포 (ipscs)는 주목할 만한 복수형 다이 신 분화 특성을 부여 받고 있으며, 이제는 운동 신경 질환1,2에 의해 영향을 받는 많은 환자 로부터 유래 되었다. MN 질환에 관련 된 병원 성 돌연변이를 운반 하는 추가 iPSC 라인은 제어 "건강 한" 만능 줄기 세포 로부터 시작 하 여 유전자 편집에 의해 생성 되었다3. 이들 라인은 MNs로의 iPSC 분화를 위한 적절 한 방법이 제공 되는 경우 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 유용한 도구를 나타낸다. 이 방법의 개발 뒤에 이론적 근거는 성숙한 기능적인 MNs를 초래 하는 빠르고 능률적인 분화 프로토콜을 가진 MN 질병에 관심 있는 과학적인 공동체를 제공 하기 위한 것입니다. 이 방법의 첫 번째 이점은 실행 시간입니다. 또 다른 강도의 포인트는 정제 단계의 제거에서 온다. 마지막으로, 프로토콜은 모터 뉴런의 두 개의 별개의 인구를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

MNs의 다른 특수형을 생성 하는 가능성은 MN 질병의 모형 화를 위해 특히 관련 됩니다. 모든 MN 특수형은 ALS와 SMA에서 동등 하 게 취약 하 그리고 다른 모터 단위에 있는 현상의 개시는 크게 예 후에 영향을 미칩니다. ALS에서, 상부 및 하 부 사지에서 시작 하는 현상에 척추 발병은 약 3-5 년에서 죽음으로 이끌어 냅니다4. 반대로, 두개골 MNs의 변성으로 시작 하는 불 바 발병은 최악의 예 후를가지고 있습니다. 더욱이, 불 바 발병의 비율은 RNA 결합 단백질 인 스와 TDP-43의 돌연변이 환자에서 SOD1 돌연변이를 가진 개인 보다 현저히 높다5. 대체 MN 분화 프로토콜의 총합은 레 틴 산 (RA)의 활동에 의존 하 여 ipscs6,7,8을 차별화 하는 척추 문자를 부여 합니다. 이것은 특정 MN 특수형9,10에서 방어적 일 수 있던 본질적인 요인 연구의 가능성을 제한 합니다.

마우스 배아 줄기 세포 (11)의 이전 작업과 일치 하 여, 우리는 최근에 인간 Ipscs에서 Ngn2, Isl1 및 LHX3 (전무)의 발현이 척추 MN 동일성을 유도 하는 반면 Ngn2 및 Isl1 플러스 PHOX2A (닙)는 두개골 MNs (12)를 지정 하는 것으로 나타났다. 우리는 따라서 효율적인 프로토콜을 개발 하 여 12 일의 턴 어 라운드에서 기능적 특성을 부여 하는 인간 MNs의 생산으로 이끌어 냅니다. 이 방법의 목적은 정제 (예를 들어, FACS)에 대 한 필요 없이 짧은 시간 프레임에서, 척추 또는 두개골 동일성을 가진 MNs에 대해 고도로 농축 된 세포 집단을 구하는 것 이다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 인간 iPSCs의 유지 보수

  1. 매트릭스 코팅 플레이트의 제조
    1. 4 ° c에서 하룻밤 동안 매트릭스의 5 mL 유리병 1 개를 해 동 ( 재료 표참조) 합니다. 원래 매트릭스 주식은 다른 주식 농도에서와 서, 개별 로트에 대 한 특정 데이터 시트에 표시 된 희석 계수에 따라 만들어집니다. 이 매트릭스의 조기 겔 화를 방지 하기 위해 바이 알 및 튜브 얼음 추위를 유지 하는 것이 중요 하다. 얼음에 미리 냉장 된 저온 튜브에 매트릭스를 추출 합니다. 미사용 분 취 액을-20°c에서 고정 합니다.
    2. 약 2 시간 동안 얼음에 1 개를 넣고 해 동 합니다.
    3. 50 mL 원뿔형 튜브에서 20 mL의 콜드 DMEM/F12를 사용 하 여 매트릭스의 취 액을 희석 하십시오.
    4. 잘 섞어서 희석 된 매트릭스 1 mL을 35 mm의 접시에 덜어 냅니다 (다른 요리의 표면적 당 균등 한 양).
    5. 코팅을 허용 하기 위해 실 온에서 1 시간 동안 희석 된 매트릭스를 포함 하는 접시를 보관 하십시오.
      참고: 파라 필름으로 밀봉 된 요리는 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
  2. 부드러운 세포 해리 시 약의 원 액 (20ml) 및 1x 작동의 제조 ( 재질 표참조).
    1. 분말을 PBS에서 10 밀리 그램/mL에 녹여드 십시오.
    2. 필터는 0.22 μ m 필터 멤브레인을 통해 멸 균 합니다.
    3. 20 분의 1을 준비 하 고 20 ° c에서 보관 하십시오.
    4. 사용 하기 전에 PBS에 1 개를 희석 하십시오 (Ca2 +/밀리 그램+ 무료).
      참고: 1 배 작업을 할 경우 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
  3. 인간 iPSCs를 통행.
    1. 시작 하기 전에: 4°c에서 저장 하는 경우, 37 ° c에서 20-30 분 동안 인큐베이터에서 사전 따뜻한 매트릭스 코팅 플레이트 인간 iPSC 배지 ( 재료 표참조)의 양이 필요 합니다. DMEM/F12를 미리 따뜻하게 합니다.
    2. 흡 기 배지.
    3. PBS로 iPSCs를 헹 구 십시오 (2 +2 + 무료).
    4. 1x 부드러운 해리 용액 (0.5 35 mm 접시)을 추가 합니다. 콜로 니의 가장자리가 플레이트에서 분리 되기 시작할 때까지 37 ° c에서 배양, 일반적으로 3-5 분.
    5. IPSC 콜로 니를 분리 하지 않도록 조심 하면서 부드러운 해리 용액을 흡입 합니다.
    6. 세포를 DMEM/F12 (35 mm의 접시)로 씻고 세포를 분리 하지 않도록 주의 하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다.
    7. 인간의 iPSC 배지를 추가 (35 mm 접시에 대 한 1 mL).
    8. 셀 리프 터로 콜로 니를 부드럽게 분리 하 고 15 mL 튜브로 이동 합니다.
    9. P1000 pior 3-4 시간으로 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 덩어리를 부드럽게 분해 하십시오.
    10. 매트릭스 코팅 플레이트 (들) 로부터 상층 액을 흡입 한다.
    11. 인간 iPSC 배지의 적절 한 배양 부피에서 세포를 종자. 분할 비율은 라인 마다 다를 수 있으며 약 1:4-1:8입니다. 매일 배지를 변경 합니다.

2. NIL 및 닙 유도성 iPSC 라인의 생성

  1. 세포 형질 감염.
    1. PBS로 세포를 헹 구 십시오 (2+ 2 + 무료).
    2. 세포 해리 시 약 ( 재료 표참조) (35 mm 접시 0.35)을 추가 하 고 단일 세포가 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다 (5-10 분).
    3. P1000 pior 3-4 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.
    4. 15ml 튜브에 넣고 10ml에 PBS (2 +/밀리 그램2 + 무료)를 추가 합니다. 셀 수를 계산 합니다.
    5. 펠 렛 (전기 천공 셀 키트에 포함 된 버퍼 R의 100 μ l에서6 개의 세포와 소생 된 10p(1 개 물질 표참조).
    6. 형질 감염에 대 한 플라스 미드 DNA 추가: transposable 벡터의 4.5 μ g (epB-Bsd-닐 또는 epB-Bsd-TT-닙) 및 0.5 μ g의 피 gybac transposable 플라스 미드13.
    7. 형질 주입는 다음 매개 변수를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한3 과 같이 셀 전기 천공 시스템 ( 재료 표참조)을 사용 합니다. 1200 V 전압, 30ms 폭, 1 펄스 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10 μ m Y-27632 (락 저 해제, 물질 표참조)로 보충 된 인간 ipsc 배지에서 세포를 종자.
  2. 항생제로 선택.
    1. 형질 감염 후 이틀 후, 배양 배지에 5 μ g/m l blasticidin을 첨가 한다.
    2. 비 형질 세포의 대부분은 blasticidin 선택의 48 시간 이내에 죽을 것 이다. 게놈에서 트랜스 유전자를 통합 하지 않은 세포를 반대 선택 하기 위해 적어도 7-10 일 동안 blasticidin의 세포를 유지 한다.
    3. 서로 다른 수의 트랜스 유전자와 상이한 통합 부위를 가진 세포로 구성 된 혼합 집단으로 서 안정적으로 형질 감염 된 세포를 유지 하거나 단일 클론을 격리 한다.
    4. 트랜스 유전자의 효과적인 발현을 확인 하기 위해 추가의 요리를 준비 하 고, 1 μ g/m l의도 자일로 핀 유도 시, Ngn2에 대 한 유전자 이식 특이 적 프라이 머를 RT-PCR에 의해 (앞으로) 역: 앞에서 설명한 바와 같이,12.
    5. 이 단계에서, 인간 Ipsc를 위한 냉동 매 질에서 신규 한 전무 및 닙-iPSC 라인의 주식을 동결 한다 ( 물질 표참조).

3. 모터 신경 분화

  1. 설명 된 대로 세포 해리 시 약으로 셀을 해리 합니다 (단계 2.1.1. 15 mL 튜브에서 해리 된 세포를 수집 하 고 DMEM의 5 볼륨/F12로 희석 하십시오. 10 μ m 록 억제제로 보충 된 인간 iPSC 배지에서 세포 및 소생을 펠 렛. 62500 셀/cm2의 밀도로 매트릭스 코팅 요리의 세포와 종자를 계산 하십시오.
  2. 다음날, 배지를 DMEM/F12로 교체 하 고 안정한 L-글루타민 아날로그 1x 비 필수 아미노산 (NEAA) 세포 배양 보조 제와 0.5 x 페니실린/streptomycin을 보충 하 고 1 μ g/m l doxyine을 함유 한다. 이것은 분화의 첫날 0으로 간주 됩니다. 1 일째에는 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.
  3. 2 일째에 배지를 신경 기저/B27 배지로 변경 (1x B27으로 보충 된 신경 기저 배지, 1 배 안정한 L-글루타민 아날로그, 1x NEAA 및 0.5x 페니실린/streptomycin), 5 μ m DAPT, 4 μ m SU5402 및 2 μ g/mL의도 시 사이 클린을 함유 합니다 (재료 표 참조). ). 5 일째까지 매일 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.
  4. 5 일: 세포 해리 시 약으로 세포 해리 ( 재질 표참조).
    1. PBS로 세포를 헹 구 십시오 (2+ 2 + 무료).
    2. 세포 해리 시 약 (0.35 35 mm 접시)을 추가 하 고 전체 세포 단층이 접시에서 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다. 단 하나 세포는 인큐베이션 도중 분리 되지 않을 것 이라는 점을 유의 하십시오.
    3. DMEM/F12 1 mL를 넣고 15 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.
    4. P1000 pior 10-15 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.
    5. DMEM/F12의 4 mL를 추가 하 고 셀을 카운트.
    6. 이 단계에서, 냉동 모터 뉴런은 제조 지침에 따라 세포 동결 매체 ( 재료 표참조)에서 조상.
    7. 10 μ m 록 억제제로 보충 된 세포와 소생 된 뉴런 배지 (20 ng/mL BDNF, 10ng/ml GDNF 및 200 ng/ml 의L-아 스 코르 브 산을 보충 하는 것과 함께 보완 된 신경 기저/B27 배지를 펠 렛.
    8. 폴 리 오 르 니 틴/라미 닌 또는 대안적으로 10만 세포의 밀도에서 매트릭스 코팅 지원에 세포를 종자/cm2. 면역 염색 분석을 위한 고분자 커버 슬립 ( 재료 표참조)과 함께 µ 플라스틱 지지대를 사용 하십시오.
  5. 6 일째에, 록 억제제가 없는 신선한 신경 매체를 사용 하 여 배지를 변경 하십시오. 다음 날, 매 3 일 마다 미디어의 절반을 새로 고칩니다. 배양 액은 표면 으로부터의 박 리를 방지 하기 위하여 매우 신중 하 게 변경 되어야 한다.

4. 면역 염색 분석

  1. 세포 고정. 세포를 PBS로 헹 구 고 (Ca2+/mg2 +) 실 온에서 4% 파라 포름알데히드 (ca 2+/mg/2 +)로 15 분간배양 합니다.
    주의: 파라 포 름 알 데히드는 독성이 며 암을 유발 하는 것으로 의심 됩니다. 피부와 눈에 닿지 않도록 하 고 화학 증기 두건에서 다루십시오.
  2. 상 온에서 5 분 동안 0.1% 트리톤 X-100을 함유 하는 PBS (Ca2 이상/2 +)와의 투과.
  3. 항 체 차단 용액에서 상 온에서 30 분 동안 배양 하 여 Ca2 +/Mg2 +와 함께 PBS에서 3% BSA를 사용 합니다.
  4. 아 BS에 있는 1 차적인 항 체를 가진 상 온에서 1h를 위해 배양 하십시오: 반대로 TUJ1 (1:1000; 1:200 Oct4) 및 안티-채팅 (안티-콜린 1:150 Acetyltransferase; 재료 표를 참조 하십시오.
  5. 적절 한 당나귀 2 차 항 체를 사용 하 여 상 온에서 45 분 동안 배양 합니다. 안티 마우스 알 렉 사 Fluor 647 (1:250), 안티 토끼 알 렉 사 fluor 594 (1:250) 및 안티 염소 알 렉 사와 플 라 이나 488 (1:250). 재료 표를 참조 하십시오.
  6. 실 온에서 5 분 동안 0.4 μ g/mL DAPI를 배양 하 여 핵에 라벨을 지정 합니다.
  7. 형광 현미경으로 이미징 하기 위해 장착 매체 ( 재료 표참조)로 셀을 마운트합니다.

5. 패치 클램프 레코딩을 통한 기능적 특성화

  1. 다음과 같이 헤 지-평형 외부 용액 (NES)을 준비 합니다. 140 염화 나트륨, 2.8 mm의 CaCl2, 2Mm mgcl2, 10mm 헵 및 10mm 포도 당. 오 스몰 농도를 290-300 m ω 사이로 설정 합니다. 1N NaOH를 사용 하 여 pH를 7.3로 조정 하 고 4°c에서 용액을 저장 한다.
  2. 내부 솔루션 준비: 140 Mmk 글 루 콘 글 루 콘, 5mm 바 브, 2mm의 MgCl 210mm헵, 0.3 mm NA-gtp. 1M KOH로 pH를 7.3로 조정 하 고 오 스몰 농도 290 m ω으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 용액을-20°c에서 작은 알리 쿠 트에 고정 하십시오.
  3. 실험을 실행 하기 전에, 물 욕조에 NES 용액을 약 28-30 ° c로 예 열 한다.
  4. 일부 붕 규 산 마이크로 피 펫을 당겨 (ID 0.86 mm; OD 1.5 mm) 팁 저항 베어링: 5-6 m ω을 입력 하 고 피 펫 홀더에 장착 하기 전에 세포내 용액으로 채웁니다.
    참고: 와이어 표면에 AgCl의 균일 한 층을 형성 하기 위해 적어도 30 분 동안 표 백제에 기록 전극 및 기준 전극의 염화 물은 와이어를 기억 한다.
  5. 기록 챔버에서 페 트리 접시를 전송 하 고 1-2 m l/min에서 NES 솔루션 챔버를 보자. 용액을 따뜻하게 유지 하기 위해 30 ° c의 온도에서 설정 된 인라인 히터를 통과 하는 흐름을 보자.
  6. 전기 생리학적 기록 챔버를 직 립 현미경으로 배치 합니다. 패치 클램프 증폭기로 멤브레인 전류를 기록 하 고 적절 한 소프트웨어로 데이터를 수집 합니다.
  7. 앰프 제어 소프트웨어를 열고 값 1과 베셀 필터의 신호 게인을 10Khz로 설정 합니다. Bessel 필터가 샘플링 주파수 보다 2.5 배 낮은 지 확인 하십시오.
  8. 기록 소프트웨어에서 전압 클램프 및 전류 클램프 실험에 대 한 실험적 프로토콜을 설정 합니다.
  9. 프로토콜 설정에서 에피소드 자극 모드를 선택 하 고 샘플링 주파수를 25khz로 설정 합니다. 그런 다음 파형 탭으로 이동 하 여 전압 또는 현재 단계 진폭 및 길이를 다음과 같이 입력 합니다.
  10. 전압 게이팅 나트륨 전류의 경우-100 mV ~ + 40 mV (10mv 증가)에서 15 개의 전압 단계 (각각 50 밀리초)를 사용 합니다. 패치 된 셀에 적용 한 후 증폭기를 통해-60 mV의 보유 전위를 유지 한 후 프로토콜을 실행 합니다. 마찬가지로, 전압 게이팅 된 칼륨 전류는 기록 된 셀을-40 mV를 유지 하는-30mv ~ + 50 mV (10mv 증분)에서 전압 단계 (각각 250 ms 지속 시간)에 의해 유발 됩니다.
  11. IPSC 유래 두개골과 척추 MNs의 소성 특성을 조사 하는 경우, 전류 클램프 모드에서-70 mV의 멤브레인 전위를 사용 하 고 증가 하는 진폭 (+ 20pa ~ + 80 pA에서 4 개의 전류 펄스)을 사용할 수 있습니다.
  12. 각 셀 전압 활성화 전류를 획득 하 고 전체 셀 커패시턴스 (Cm), 세포 막 저항 (Rm) 및 휴식 막 전위 (RMP)로 서의 소성 활성 및 3 개의 패시브 특성을 유발 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분화 방법에 대 한 개략적인 설명을 도 1에 나타내 었 다. 인체 iPSCs (WT I 라인3)는 epb-유도성 및 엡-닙으로 서,이 하에서 blasticidin 선택에 의해 생성 되 고, 안정적이 고, 그리고이 하 세포 주 (12) 들을 각각에 펙 스-닐 및 ipscs-닙에 의해 서 형질 감염 시켰다. 분화 세포는 다능 성 마커 OCT4 및 범 뉴런 마커 TUJ1의 발현을 특징으로 하였다. 면역 염색 분석은 TUJ1 양성의 부재 하에, 0 일째에 모든 세포에서 OCT4의 균일 한 발현을 나타내 었 다 (도 2A). 셋째 날, 우리는 OCT4 세포의 수에 있는 강한 감소를 관찰 하였으며,이는 iPSCs의 차별화의 하위 집합에서 TUJ1의 발현에 의해 미러링 되었습니다 (그...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 효율적으로 인간 ipscs를 척추 및 두개골 운동 뉴런으로 변환 하 여 계보 관련 특정 전사 인자의 자 궁 외 발현을 가능 하 게 합니다. 이들 트랜스 유전자는 독 시 사이 클린에 의해 유도성 되 고, piggyBac 전치 자 기반 벡터 덕분에 게놈에 안정적으로 통합 된다. 혼합 된 집단에서, piggyBac 벡터의 하나 또는 여러 사본은 개별 세포의 게놈에 무작위로 통합 될 것이 고, 게놈 완전성 변경의 리스크를 증가 합니다. 더욱이, iPSC 서브 클론의 진보적인 선택은 분화에 대 한 가능한 결과와 질병 및 대조 군 세포 선의 비교 분석을 위해 시간이 지남에 따라 발생할 수 있습니다. 모두, iPSC-유래 MNs이 프로토콜을 얻은 재생 의학에 적합 하지 않습니다. 그러나, 우리의 방법은 생체 외 운동 신경 질환 모델링에 특히 유용 할 수 있다. 주요 강도 지점은 매우 단순화 된 배양 조건, MN 변환의 신속성, iPSC 유래 MNs의 높은 성숙도 및 이전에 입증 된 것 처럼 척추 및 두개골 MNs를 모두 얻을 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 생명의 나노 과학 센터에서 이미징 시설에 감사 하 고 싶습니다.,이 스 티토 하세가와 디 Tecnologia, 지원 및 기술 조언을. 우리는 생명 나노 과학 센터의 회원 들에 게 도움이 되는 토론에 감사 드립니다. 이 작품은 AriSLA (파일럿 그랜트 2016 "StressFUS")의 보조금에 의해 부분적으로 AR에 지원 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5-BaptaSigma-AldrichA4926-1G전기생리학적 솔루션을 위한
화학물질 AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML 세포 해리 시약
안티-챗EMD 밀리포어 AB144P항콜린 아세틸전이효소. 면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. RRID: AB_2079751; 로트 번호: 2971003
안티-염소 Alexa Fluor 488 써모 피셔 사이언티픽 A11055immonofluorescence assay에 사용되는 2차 항체. RRID: AB_2534102; 로트 번호: 1915848
안티-마우스 Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific A31571immonofluorescence assay에 사용되는 2차 항체. RRID: AB_162542; 로트 번호: 1757130
anti-Oct4 BD Biosciences611202면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. RRID: AB_398736; 로트 번호: 5233722
anti-Phox2bSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-376997면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. 로트 번호: E0117
안티-토끼 Alexa Fluor 594 Immunological SciencesIS-20152-1immonofluorescence assays
anti-TUJ1에시그마-알드리치 T2200면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566신경 세포 유지를 위한 무혈청 보충제
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02세포 동결 매체, 운동 뉴런 전구 세포에 사용
BDNFPreproTech450-02Brain-Derived Neurotrophic Factor
BlasticidinSigma-Aldrich203350원핵생물 및 진핵생물에서 단백질 합성을 억제하는 뉴클레오시드 항생제
BSA시그마-알드리치A2153소 혈청 알부민. 면역염색 분석에서 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위한 차단제
CaCl2Sigma-AldrichC3881전기생리학적 솔루션용 화학물질
Clampex 10 소프트웨어Molecular DevicesClampex 10멤브레인 전류 기록 시스템
Corning Matrigel hESC 인증 MatrixCorning 354277Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 육종에서 재구성된 기저막 준비. 플라스틱 및 유리 지지대에 iPSC를 접착하는 데 사용
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1E인간 iPSC용 동결 매체
D-GlucoseSigma-AldrichG5146전기생리학적 솔루션용 화학 물질
DAPI 분말Roche102362760014′, 6-디아미디노-2-페닐린돌. 아데닌&ndash에 결합하는 형광 염색제; DNA에 티민이 풍부한 영역이 있는데, 이는 immonofluorescence assay에서 핵 염색에 사용됩니다
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005감마 분비효소 억제제
DispaseGibco17105-041인간 iPSC의 부드러운 해리를 위한 시약
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500ML세포 배양을 위한 기초 배지
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1G& 주의;epB-Bsd-TT-NIL 및 epB-Bsd-TT-NIP 벡터에서 전이유전자 발현을 유도하는 데 사용됩니다.
DS2U WiCellUWWC1-DS2U상업용 인간 iPSC 라인
E.Z.N.A 총 RNA 키트 Omega bio-tekR6834-02배양된 진핵 세포에서 RNA를 완전히 추출하기 위한 키트
GDNFPreproTech450-10신경교세포 유래 신경 영양 인자
Gibco Episomal hiPSC 라인Thermo Fisher ScientificA18945상업용 인간 iPSC 라인
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038안정성이 향상된 L-글루타민의 대안. 세포 건강을 개선합니다.
HepesSigma-AldrichH4034전기생리학적 솔루션을 위한
화학물질 iScript 역전사 슈퍼믹스 RT-qPCR용 를 사용한 유전자 발현 분석을 위한Bio-Rad
 바이오 라드172-5121 모든 Real-Time PCR 기기에서 염료 기반 정량 PCR(qPCR)에 최적화된 즉시 사용 가능한 반응 마스터 믹스
K-GluconateSigma-AldrichG4500전기생리학적 용액용 화학물질
KClSigma-AldrichP9333전기생리학적 용액용 화학물질
L-아스코르브산LKT LaboratoriesA7210세포 배양에 항산화제로 사용
라미닌Sigma-Aldrich11243217001in vitro에서 신경 세포의 부착 및 성장 촉진
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 올림푸스  면역 염색 이미지 획득을 위한 iX83 FluoView1200컨포칼 현미경
Mg-ATPSigma-AldrichA9187전기생리학적 솔루션을 위한 화학물질
MgCl2Sigma-AldrichM8266화학물질 전기생리학적 솔루션을 위한
화학물질 장착 매체 Ibidi50001컨포칼 현미경 검사 및 면역 형광 분석에 사용되는 마운팅 솔루션
멀티클램프 패치 클램프 증폭기분자 장치700B멤브레인 전류 기록 시스템
Na-GTPSigma-AldrichG8877전기생리학적 솔루션용 화학 물질
NaClSigma-Aldrich71376전기생리학적 솔루션용 화학 물질
NEAAThermo Fisher Scientific11140035비필수 아미노산. 세포 성장과 생존력을 높이기 위해 세포 배양 배지의 보충제로 사용됩니다.
네온 100 μ L 키트Thermo Fisher ScientificMPK10096세포 전기천공법 키트
Neon Transfection 시스템Thermo Fisher ScientificMPK5000세포 전기천공법 시스템
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049신경 세포 집단의 장기 유지 및 성숙을 위해 설계된 기저 배지
 Biological Industries05-100-1A인간 iPSC 배양 배지
파라포름알데히드전자 현미경 과학157-8면역 염색 분석에서 세포 고정에 사용
PBSSigma-AldrichD8662-500MLDulbecco의 인산염 완충액 식염수, 칼슘 포함, 마그네슘
PBS Ca2+/Mg2+ 무료Sigma-AldrichD8537-500MLDulbecco의 인산염 완충액 식염수, 칼슘 없음, 마그네슘
페니실린/스트렙토마이신 없음 Sigma-AldrichP4333-100ML페니실린/스트렙토마이신 용액은 박테리아의 세포 배양 오염을 방지하는 데 사용됩니다.
폴리-오르니틴시그마-알드리치P4957체외에서 신경 세포의 부착 및 성장을 촉진
SU5402시그마-알드리치SML0443-5MG혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2)의 선택적 억제제
트리톤 X-100 시그마-알드리치T87874-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜,  t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜  tert-옥틸페닐 에테르. 면역염색 분석에서 세포 투과화에 사용됩니다
OlympusBX51VI현미경은 CoolSnap Myo 카메라가 장착된 전기생리학적 기록에 사용됩니다.
Y-27632  (ROCK 억제제)엔조 생명과학ALX-270-333-M005 Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK)의 세포 투과성 선택적 억제제. iPSC 생존율 증가
μ-Slide 8 Well Ibidi80826high&ndash 지원; 고정 세포의 현미경 분석 종료
사용되는 2차 항체;. Real-Time qPCR iTaqTM Universal SYBR Green Supermix 1708841 키트 성상세포 공급층 NutriStem-XF/FF 없이 은 합니다. .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationPiggyBac VectorsNgn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2aSpinal Motor NeuronsCranial Motor NeuronsDoxycycline InductionCholine AcetyltransferaseAction Potential Firing

관련 논문