여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.
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방법 논문
혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
내피형및 형태학에 있는 비정상적인 변경은 동맥 경화증의 병인에 있는 초기 사건으로 여겨져. 본래 내피의 직접적인 관찰은 기능 장애 내피 세포에서 세포 및 분자 사건을 이해하는 귀중한 정보를 제공 할 것이다. 여기에서, 우리는 과학자들이 손상되지 않은 내피 표면의 명확한 심상을 얻고 그 자리에서 분자 발현 패턴을 분석하는 것을 가능하게 하는 변형된 en face 면역형광 염색 기술을 기술합니다. 이 방법은 대공의 다른 부위에서 전체 내피 단층을 관찰하기위한 간단하고 신뢰할 수 있습니다. 이 기술은 특히 초기 단계에서 동맥 경화증의 병리생리학을 이해하는 유망한 도구가 될 수 있습니다.
서론
혈관 구조의 초기 변화는 주로 내피에서 시작되며, 이는 세포 간 단단한 접합 복합체와 함께 혈액과 혈관 벽 사이의선택적 장벽으로 기능합니다 1. 실질적인 증거는 내피 기능 조절에 혈류의 기계적 효과에 대한 중요한역할을 가리킵니다 2. 유체 전단 응력, 혈류에 의해 생성되는 마찰력, 상이한 혈관 부위의 특정 흐름 패러다임에 따라내피 세포 형태 및 기능을 차별화하여 형성한다 2,3. 죽상 경화성 병변은 동맥의 직선 세그먼트와 같은 꾸준한 흐름 (s-flow)의 영역과 비교하여 혈관 곡률, 흐름 분배기 및 분기 점과 같은 방해 된 혈류 (d-flow)의 부위에서 우선적으로 발생합니다. 따라서, 내피 형태와 분자 발현 패턴의 직접적인 관찰은 다양한 흐름 패러다임하에서 내피 세포의 구조적 및 기능적 표현형에 대한 중요한 통찰력을 제공해야합니다.
배양된 내피 세포는 유체 전단 스트레스, 주변 사이토카인, 세포 세포 또는 세포 외 매트릭스 상호작용의 충격의 손실로 인해 생체 내에서 부분적으로 수행되는 것처럼 실제 표현형을 발현하지 않을 수 있다. 이를 돕기 위해, 본....
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프로토콜
모든 동물 실험은 상하이 자오퉁 대학의 동물 자원위원회가 승인한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 마우스 대류의 관류
- 간단히, 12 주 된 C57BL/6 쥐 나트륨 pentobarbital의 복 강 주사와 쥐를 마 사 (50 mg/kg 체중). 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다.
참고: 움직임이 관찰되지 않으면 동물은 충분히 마취되어 실험을 시작합니다. - 마우스의 발을 접착제 테이프로 종이 타월 더미에 테이프로 바힙니다.
- 포셉으로 마우스의 피부를 잡고 복부에서 흉부 의 상단까지 가위로 피부를 잘라.
- 날카로운 가위로 흉곽 아래복 구멍을 엽니다.
- 포인원으로 흉골을 들어 올리고 횡격막을 잘라; 그런 다음 흉곽을 잘라 흉강을 노출시하십시오.
- 가위로 간 바로 위의 베나 카바를 잘라냅니다.
- 압력 응과 (100 mmHg) 폐와 간이 창백해질 때까지 좌심실을 통해 40 단위 / mL 헤파린을 포함하는 미리 냉각 된 정상 식염수로 5 분 동안 동맥 나무를. 이어서, 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에서 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드를 3분 동안 응비한다.
- 대반이 노출될 때까지 모든 근....
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결과
12주 된 C57BL/6 마우스를 안락사시키고 40 단위/mL 헤파린을 함유한 일반 식염수로 주입한 다음, 4% 파라포름알데히드를 미리 냉각시켰습니다. 마우스 대공은 해부 현미경(도 1)에노출되었고, 해부하고, 세로로 절단하였다(도2). 혈관 내피 세포의 En 얼굴 면역형광 염색은 도 3 및 표1에 예시된 바와 같이 수행되었다. 혈관세포 접착 단백질-1(VCAM-1)의 면역형형 면역형단백질-내피 마커로서 VE-카데린을 발현하여 마우스 대동맥의 상이한 영역에서 다양한 흐름 패턴하에 나타내졌다. DAPI는 또한 더 나은 시각화를 위해 세포 핵을 보여주기 위해 역태화되었다. 내피 세포 핵은 타원형이고 스핀들 모양보다 더 크기 때문에 내피 및 평활근 세포는 현미경의 밑에 z.......
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토론
내피는 지질, 염증성 매개체 및 유체 전단 응력1,11,12를포함하는 수많은 프로테로겐성 인자에 노출된다. 이 소동에서 내피 세포를 직접 관찰하는 것은 부상 자극에 반응하여 세포 형태, 세포 간 접합부 및 분자 발현 패턴의 변화를 분석하는 특별한 이점을 제공한다.
이전 연구는 동맥 벽의 내피를 관찰하기 위해 두 개의 상이한 enface 면역성 화학 기술을 제공했다 4,5. 하나는 특별한 기술에 의해 혈관 벽으로부터 내피내피를 제거함으로써 내피 단층을 얻는 것이며, 이는 마스터하기 어렵고 동맥의 분지 부위에서 많은 내피의손실을 초래할 수 있다 4. 다른 하나는 우리가 설.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 81670451, 81770430), 상하이 라이징 스타 프로그램 (그랜트 번호 17QA140300), 상하이 시 정부의 과학 기술위원회 (그랜트 번호)에 의해 지원되었다. 14441903002, 15411963700).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| 섬세한 집게 | RWD 생명 과학 | F11001-11 | |
| 섬세한 가위 | RWD 생명 과학 | S12003-09 | |
| 해부 집게 | RWD 생명 과학 | F12005-10 | |
| Mciro 봄 가위 | RWD 생명 과학 | S11001-08 | |
| 폴리옥시에틸렌, 옥틸 페닐 에테르(Triton X-100), | Amresco | M143 | |
| 폴리소르베이트 20(트윈 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 항체 | , Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin 항체 | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 표지, 토끼 방지 IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 표지 항쥐 IgG | invitrogen | A-21208 | |
| 레이저 스캐닝 현미경 | 칼 자이스 |
참고문헌
- Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and ....
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재인쇄 및 허가
