이 연구는 정확도, 감도 및 높은 처리량을 동시에 달성하기 위해 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자를 식별하는 기존의 독성 아날로그 기반 방법에 대한 대체 전략을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
아미노산에 대한 계속 성장하는 시장을 만족시키기 위해서는 고성능 생산 균주가 필요합니다. 아미노산 과잉 생산자는 아미노산과 그들의 유사체 사이 경쟁을 이용하 여 전통적으로 확인됩니다. 그러나, 이 아날로그 기반 방법은 낮은 정확도이며, 특정 아미노산에 대한 적절한 유사체는 제한된다. 여기에서는 희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자의 정확하고 민감하며 처리량이 높은 스크리닝을 가능하게 하는 대체 전략을 제시합니다. 이 전략은 코돈이 코딩 DNA에서 발생 빈도에 따라 일반적이거나 희귀 한 것으로 분류되는 단백질 번역에서 코돈 사용 편향현상에서 영감을 받습니다. 희귀 코돈의 번역은 기아하에 코그네이트 아미노산에 의해 완전히 충전 될 수없는 해당 희귀 전사 RNAs (tRNAs)에 달려 있습니다. 이론적으로, 희귀 한 tRNAs는 동의어 일반적인 이소 수용인을 충전 한 후 아미노산의 잉여가있는 경우 충전 될 수있다. 따라서, 희소한 코돈에 기인한 지체번역은 대응하는 아미노산의 공급 또는 세포내 과잉 생산에 의해 복원될 수 있었다. 이러한 가정하에, 표적 아미노산의 일반적인 코돈들을 항생제 내성 유전자 또는 유전자의 동의어드문 대안으로 대체함으로써 아미노산 과잉 생산자를 식별하기 위한 선택 또는 스크리닝 시스템이 확립된다. 형광 또는 발색성 단백질을 인코딩합니다. 우리는 단백질 발현이 희소한 코돈의 통합에 의해 크게 방해될 수 있고 단백질의 수준이 아미노산 농도와 긍정적으로 상관관계가 있다는 것을 보여줍니다. 이 시스템을 사용 하 여, 여러 아미노산의 과잉 생산자 돌연변이 라이브러리에서 쉽게 밖으로 선별 될 수 있습니다. 이 희소한 코돈 기지를 둔 전략은 단지 단 하나 수정한 유전자를 요구하고, 호스트는 그밖 방법에서 보다는 선택을 탈출하기 위하여 확률이 낮습니다. 그것은 아미노산 과잉 생산자를 얻기 위한 대체 접근 을 제안 합니다.
서론
아미노산의 현재 생산 발효에 크게 의존. 그러나, 대부분의 아미노산 생산 균주에 대한 적시및 수율은 수십억 달러의 가치가 있는 글로벌 아미노산 시장의 수요 증가에 미치지못하고1,2. 고성능 아미노산 과잉 생산자를 얻는 것은 아미노산 산업의 업그레이드에 매우 중요합니다.
아미노산 과잉 생산자를 식별하는 전통적인 전략은 단백질 합성에서 아미노산과 그유사체 사이의 경쟁을 악용 3,4. 이들 유사체는 상응하는 아미노산을 인식하고 펩티드 사슬의 연신을 억제하는 tRNAs를 충전할 수 있으며, 이는 체포된 성장 또는 세포 사멸을 초래한다5. 아날로그 응력에 저항하는 한 가지 방법은 세포 내 아미노산의 농도를 증가시키는 것입니다. 농축 된 아미노산은 유한 tRNAs에 대한 유사체를 능가하고 기능성 단백질의 올바른 합성을 보장합니다. 따라서, 유사체에서 살아남는 균주를 선택할 수 있고 상응하는 아미노산의 과잉 생산자일 가능성이 있다.
L-류신 6와 같은 아미....
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프로토콜
1. 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자를 발현하는 플라스미드의 구축
- 표적 아미노산에 대한 적절한 수의 공통 코돈이 포함된 마커 유전자를 선택한다.
참고: L-류신의 경우, 29개의 류신 코돈이 함유된 카나마이신 내성 유전자 kanR은 27개의 일반적인 코돈이며, 선택시스템(13)의시공에 사용된다. 19개의 류신 코돈 중 17개의 일반적인 코돈, 또는 보라색 단백질 인코딩 유전자 prancerpurple (ppg)를 포함하는 gfp 유전자는, 14 leucine 일반적인 코동을 항구하는, 검열 체계를 위해 이용됩니다 (보충표 1 ). - 마커 유전자의 일반적인 코돈들을 동의어인 희귀 코돈으로 대체합니다. L-류신의 경우, 칸 R, gfp,또는 ppg에서 코동을 희귀 코돈 CTA로 교체하고, kanR-RC, gfp-RC,또는 ppg-RC를생성하며, 각각13 보충 표1).
참고: 마커 유전자에....
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결과
선택 시스템의 경우, 희귀 코돈이 풍부한 항생 저항 유전자를 품고 있는 균주에 대한 OD600의 급격한 감소는 야생형 항생저항유전자를 배양할 때 균주에 비해 관찰되어야 한다. (그림1a)를참조하십시오. 동일한 조건하에서, 항생저항성 유전자에서 희귀 코돈의 수가 증가함에 따라 세포 OD600의 감소가 더욱 명백해진다(도1a). 단백질 발현에 대한 희귀 코돈의 억제는 대부분 굶주인 조건에서 일어난다는 점에 유의해야합니다. 따라서, LB 배지가 적절히 희석되지 않은 경우, 야생형 유전자를 항하는 균주에 비해 희귀코돈이 풍부한 마커 유전자를 항재하는 균주에 대해 세포OD(600)의 유의한 감소가 관찰되지 않을 것이다(도1b). 상응하는 아미노산의 추가 수유 후,.......
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토론
마커 유전자및 선택 또는 스크리닝 배지에서 희귀 코돈의 수는 희귀 코돈 변형 마커 유전자로부터단백질 발현을 억제하는 데 중요하다. 야생형 마커 유전자와 이들의 유도체로부터의 단백질 발현 사이에 유의한 차이가 검출되지 않으면, 희귀 코돈의 수를 증가시키거나 영양분 제한 배지를 사용하여 차이를 증폭시킬 수 있다. 그러나, 억제 효과가 너무 강한 경우, 단백질 발현은 해당 아미노산의 추가 공급에 의해서도 회복되지 않을 수 있다. 이 경우, 마커 유전자의 희귀 코돈의 수는 스트레스의 일부를 완화하기 위해 감소되어야한다. 선택 또는 스크리닝 엄격성을 미세 조정하는 또 다른 방법은 희귀 코돈이 풍부한 마커 유전자의 카피 수 및 발현 수준을 조정하는 것입니다. 마커 유전자의 카피 수 및 발현 수준을 감소시키는 것은 일반적으로 아미노산 과잉 생산자와 초기 긴장 사이 더 강한 분화로 이끌어 냅니다. 따라서, p15A 또는 pSC101과 같은 낮은 카피 수 복제 기원뿐만 아니라 약한 프로모터를 포함하는 벡터를 사용해야 한다. 마커 유전자가 유도성.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(보조금 제21676026호), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFD0201400), 중국 박사후 과학 재단(2017M620643)이 공동으로 지원했습니다. UCLA 진보 연구소 (소주)의 작품은 장쑤성과 쑤저우 산업 단지의 내부 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
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| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 컬럼 Agilent | 959759-902케이 |
참고문헌
- Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA cod....
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