배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.
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방법 논문
낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략
이 논문에서
요약
초록
세포 독성은 치료 혜택을 가질 수 있는 약물을 공부할 때 정량화 될 필요가 중요 한 매개 변수. 이 때문에, 많은 약물 스크리닝 검사는 개별 화합물에 대해 프로파일화되는 중요한 특성 중 하나로 세포 독성을 이용한다. 배양되는 세포는 더 비싸고 노동 집약적인 동물 모형에 있는 유망한 지도 화합물에 후속을 진행하기 전에 세포 독성을 평가하는 유용한 모형입니다. 우리는 인간 신경 줄기 세포 (NSC) 선을 표현하는 tdTomato에 있는 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 확인하는 전략을 기술합니다. 이 전략은 세포 수를 평가하기 위해 2개의 상보적인 assays를 이용합니다. 1개의 분석제는 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 브로마이드(MTT)의 감소를 통해 세포 수에 대한 프록시로서 포르마잔을 하고 다른 하나는 직접 TdTomato 발현 NSC를 계산한다. 2개의 실험은 단 하나 실험에서 동시에 수행될 수 있고 노동 집약적이고, 급속하고, 저렴하지 않습니다. 이 데모에 설명된 전략은 96웰 플레이트 형식의 독성에 대한 예비 1차 화면에서 57개의 화합물을 테스트했습니다. 3개의 안타는 1차 화면과 동일한 분석 설정을 사용하여 6점 투여 반응에서 더 특징을 보였다. 독성에 대한 우수한 부식을 제공하는 것 외에도, 두 가지 측정법의 결과의 비교는 세포 성장의 다른 양상에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 데 효과적일 수 있다.
서론
치료 잠재력을 가지고 있는 화학 화합물에 대 한 결정 해야 하는 가장 중요 한 특성 중 하나는 동물 세포에 그것의 독성. 이 특성은 약물이 더 광범위한 연구를위한 좋은 후보인지 여부를 결정합니다. 대부분의 경우, 최소한의 독성을 가진 화합물이 모색되지만 특정 세포 유형을 죽일 수 있는 능력을 가진 화합물이 관심있는 상황이 있습니다, 예를 들어, 항 종양성 약물. 전체 동물이 전신 독성을 결정하는 가장 좋은 모델 시스템이지만, 몇 가지 화합물을 테스트해야 할 때 관련된 비용과 노동력은 엄다합니다. 이와 같은 포유류 세포 배양은 일반적으로 가장 효율적인대안1,2로사용된다. 중소형 처리량 약물 스크린은 세포 배양에서 독성을 평가할 수 있는 중요한 양상입니다. 이러한 화면은 개별 신호 경로를 대상으로 하는 추가라이브러리를 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 스크린의 일반적인 형식은 처음에 예비 1차 독성 화면에서 단일 용량(일반적으로 10 μM)으로 라이브러리의 모든 화합물을 테스트한 다음, 독성을 완전히 특성화하기 위해 심층적인 이차 용량 응답 스크린을 수행하는 것입니다. 기본 화면에서 조회수의 프로필을 볼 수 있습니다. 이 전략을 구현하는 방법은 여기에 설명되어 독성 화합물을 식별하고 ....
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프로토콜
1. NSC 문화
참고: 인간 NSC 라인의 조작은 아래에 설명될 것이지만 모든 세포주가 이 프로토콜에 사용될 수 있다. 모든 세포 배양 작업은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
- 지하 막 / 세포 외 매트릭스 (ECM)로 96 웰 플레이트를 코팅하십시오.
- 얼음에 NSC의 부착을 용이하게하는 ECM(재료의 테이블)의aliquot를 해동합니다. ECM을 10 mL 염기배지(표)에서적절한 농도(일반적으로 1:100)로 희석하고, 96웰 플레이트의 60개의 내부 웰각각에 웰당 50 μL을 첨가한다(그림1). 가장자리 효과16에서발생할 수 있는 아티팩트를 피하기 위해 내부 60웰만 사용하십시오.
- 플레이트를 실온 또는 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에적어도 30분 동안 앉게 한다.
- 해리 및 플레이트 신경 줄기 세포.
참고: 이 방법에서 사용하기 위한 세포는 T75 플라스크에서 적어도 80% 합류로 성장되어야 한다.- 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 ....
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결과
자동화된 셀 카운트 데이터는 DMSO 제어로 정규화될 때 25% 미만의 생존율로 11개의 화합물을 확인했으며 MTT 데이터는 이러한 동일한 화합물과 2개의 추가 화합물을 확인하였다(표1 및 표 2,적색). MTT 분석(wells F3 및 G10)에서만 독성이 있는 것으로 밝혀진 두 화합물은 각각 31%와 39%를 가졌고, 대조군및 계급 순서에 의한 tdTomato 양성 세포의 수는 독성으로 간주된 후 이 라이브러리에서 다음으로 가장 독성이 강한 화합물 2개였다. 이 두 웰의 표준 편차 값은 평균을 왜곡한 세 개의 플레이트 사이에 이상치가 있음을 시사하지 않았으며, 세 개의 복제 플레이트 각각에 대한 숫자를 조사할 때 어느 쪽도 25% 임계값 아래로 떨어졌습니다. (데이터가 표시되지 않음) tdTomato 형광의 대표적인 이미지는 그림 3의여러 우물에서 표시됩니다. MTT와 세포 수 분석 사이의 독성에 대한 불협화음의.......
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토론
이 문서의 주요 목표는 낮은-중간 처리량 스크리닝에서 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 효율적이고 저렴하게 식별할 수 있는 전략을 설명하는 것이었습니다. 2개의 직교 기술은 결론에 있는 신뢰를 증가하고 단 하나 분석분석만 사용된 경우에 유효하지 않을 추가 통찰력을 제안하기 위하여 세포 수를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 상기 한 가지 는 형광 세포 이미저를 사용하여 tdTomato 양성 세포를 직접 카운트하고 두 번째는 MTT를 포르마잔으로 갈라서 세포 번호10의프록시역할을 하는 미토콘드리아의 잘 특성화된 능력에 의존하였다. 분석의 MTT 날개가 2,000 화합물14만큼라이브러리를 테스트하는 데 사용되었지만 총 57 개의 시험 화합물이 이 데모에서 평가되었습니다. 스크린의 결과는 두 개의 계산서가 더 자신있게 특정 결론에 도달하기에서 서로를 강화할 수 있는 방법을 지적하고, 두 개의 계산제가 일반적으로 추가 정보를 제공하는 상호 보완적인 시.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | 신경 줄기 세포 배지 구성 요소 |
| 벤치탑 피펫터 | Sorenson Bioscience | 73990 | 한 번의 샷으로 화합물 라이브러리를 96웰 플레이트에 피펫팅할 수 있는 기능을 제공합니다. |
| BioLite 96웰 멀티디쉬 | Thermo Scientific | 130188 | 모든 96웰 세포 배양 플레이트가 작동합니다. 우리는 이것을 우리의 작업에 사용합니다. |
| 세포 배양 현미경 | Nikon | Eclipse TS100 | 적절한 밀도를 보장하기 위한 세포의 육안 검사. |
| Cytation 5/ 이미징 리더 | BioTek | CYT3MFV | 세포 이미징 및 흡광도 판독에 사용됩니다. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | 스크린에 사용되는 화합물용 용매. 흡광도 측정을 용이하게 하기 위해 MTT 침전물을 용해시킵니다. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 신경 줄기 세포 배지 구성 요소. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | 신경 줄기 세포 기저막 매트릭스. 세포를 세포 배양 플레이트에 부착할 수 있습니다. |
| Gen5 3.04 | BioTek | 분석 소프트웨어는 tdTomato 발현 세포의 세포 수를 측정합니다. | |
| 글루타민 | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 신경 줄기 세포 배지 구성 요소. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | 화합물 라이브러리 저장. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | 세포 생존율을 측정하기 위한 활성 분석 시약. |
| 멀티채널 피펫 | Rainin | E8-1200 | 세포 배양 배지, MTT 또는 DMSO의 컬럼별 첨가. |
| Neurobasal 배지 | ThermoFisher Scientific 21103049 | 신경 줄기 세포 기본 배지. | |
| RFP 필터 큐브 | BioTek | 1225103 | 필터는 tdTomato 발현 세포를 이미지화하는 데 사용되는 Cytation 5의 필터입니다. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | 세포 해리 시약. |
참고문헌
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology
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재인쇄 및 허가
