방법 논문

플라바놀에서 플라보놀의 생합성은 원팟 비엔자이매틱 캐스케이드를 확립하여

DOI:

10.3791/59336

⸱

2019년 8월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, 2Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture of China, Yangzhou University, 3Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety, Yangzhou University, 4Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 5The Testing Center, Yangzhou University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

플라보놀의 유도는 의료 및 식품 산업에서의 응용에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 플라바논의 플라보놀의 생합성을 위한 상세한 프로토콜을 제공하고 그밖 접근에 비해 중요한 단계 및 그것의 이점에 토론합니다.

초록

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플라보놀은 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가진 플라보노이드의 주요 하위 클래스입니다. 여기서, 우리는 플라보놀의 시험관 내 효소 합성을 위한 방법을 제공한다. 이 방법에서는 플라보놀의 생합성 경로에 있는 두 가지 주요 유전자인 Atf3h와 Atfls1이 대장균에서복제되고 과발화됩니다. 재조합 효소는 친화성 컬럼을 통해 정제되고 그 후 비엔자이매틱 캐스케이드가 특정 합성 완충제에 확립됩니다. 두 개의 플라보놀은 이 시스템에서 예로 합성되며 TLC 및 HPLC/LC/MS 분석에 의해 결정됩니다. 이 방법은 다른 접근법에 비해 플라보놀의 유도에 명백한 이점을 표시합니다. 그것은 시간과 노동 을 절약하고 매우 비용 효율적입니다. 반응은 정확하게 제어하기 쉽고 따라서 대량 생산을 위해 확장됩니다. 대상 제품은 시스템의 간단한 구성 요소로 인해 쉽게 정제 될 수 있습니다. 그러나,이 시스템은 일반적으로 플라바네에서 플라보놀의 생산으로 제한됩니다.

서론

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플라보놀은 식물 플라보노이드의 주요 하위 클래스이며 식물 개발 및색소 침착 1,2,3에관여합니다. 더 중요한 것은, 이 화합물은 항암제 4,5,산화6,항염증제 7, 항비만8,항고혈압 제 9와 같은 건강에 유익한 활동의 넓은 범위를 가지고 있습니다 , 및 메모리 리콜 속성10,이러한 식물 유래 보조 대사 산물에 대한 연구의 큰 숫자로 이어지는. 전통적으로, 이러한 화합물은 주로 유기 용매를 사용하여 식물 추출에서 파생됩니다. 그러나 식물11,12,13의함량이 매우 낮기 때문에 대부분의 플라보놀의 생산 비용은 여전히 높으며, 이는 의료 및 식품 분야에서의 적용에 큰 제한을 가합니다. 산업.

지난 수십 년 동안 과학자들은 플라보노이드14,15을파생하는 많은 방법을 개발했습니다. 그러나, 이러한 복잡한 분자의 화학적 합성은 다양한 본질적 단점을 가지고있다 16. 독성 시약 및 극단적인 반응 조건뿐만 아니라 표적 플라보노이드화합물(14,17)을생성하는 많은 단계도 필요하다. 더욱이, 이 전략에 있는 또 다른 중요한 도전은 액티브한 플라보노이드 분자의 키랄 종합입니다. 따라서 화학 합성16,17을통해 상업적 규모로 플라보노이드를 생산하는 것은 이상적인 전략이 아닙니다.

최근 과학자들은 플라보노이드 생합성 경로를 가진 미생물을 엔지니어링하여 이러한 복잡한 천연 화합물을 생산하는 유망한 대체 전략을 개발했습니다18,19,20, 21세 , 22,이는 성공적으로 식물23에서해독되었습니다. 예를 들어, Duan 등은 개화 효모 사카로미세세스 세레비시아에 생합성 경로를 도입하여 kaempferol(KMF)24를생산하였다. Malla et al. 아스트라갈린, 글리코실화 플라보놀,플라바노3-하이드록실라제(f3h),플라보놀 신타제(fls1), UDP-글루코골트랜스퍼라제:플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼랙타제 UGT78K1 유전자를 도입하여 대장균BL21 (DE3)17. 비록 꽤 많은 패러다임이 있지만, 모든 유전자 조작 미생물은 세포 플랫폼의 복잡성, 인위적으로 합성 된 유전 요소와 숙주 사이의 비호환성, 억제력으로 인해 관심있는 제품을 생산하지는 않습니다. 숙주 세포에 대한 표적 제품의 효과, 그리고 엔지니어링 된 세포 시스템 자체의 불안정성16.

플라보노이드 생산을 위한 또 다른 유망한 대안 전략은 시험관내에서 다중 효소 캐스케이드를 확립하는 것입니다. Cheng 외. 엔테로신 폴리케타이드는 하나의 냄비(25)에 완전한 효소 경로를 조립함으로써성공적으로 합성될 수 있다고 보고되었다. 이 무세포 합성 전략은 미생물 생산 공장의 제한을 우회하므로 일부 플라보노이드를 대량으로 생산할 수 있습니다16.

최근에는 나린게닌(NRN)을 한 냄비에 KMF로 변환하는 이효소합성 시스템을 성공적으로 개발했습니다. 여기에서는 이 시스템을 자세히 설명하고 제품 분석과 관련된 방법을 설명합니다. 우리는 또한 NRN에서 KMF를 생산하기 위해이 시스템을 사용하는 두 가지 예를 제시하고 eriodictyol에서 케르세틴 (QRC)(ERD). 또한, 우리는 플라보노이드의 생합성에 있는 이 방법의 중요한 단계 및 미래 연구 방향을 토론합니다.

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프로토콜

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1. 식물 조직에서 총 RNA를 분리26,27

  1. 식물 조직을 균질화하십시오.
    1. 신선한 식물 조직 100 mg을 수집하십시오 (예를 들어, 애기장대에서4 주 된 모종). 액체 질소로 조직과 유봉과 박격포를 동결한 다음 조직을 분말로 분쇄합니다.
    2. RNA 분리 시약 1mL를 첨가합니다(재료 표참조). 시약은 즉시 동결됩니다. 냉동 시약이 녹으면 유봉으로 조직 샘플을 균질화합니다.
    3. 1.5 mL 튜브로 균질화를 전달하고, 4°C에서 5분 동안 12,000 x g에서 샘플을 원심분리한 다음, 제거된 균질성 용액을 다른 신선한 1.5-mL 튜브로 옮긴다.
    4. 실온에서 균질화된 샘플을 5분 동안 배양합니다.
  2. 총 RNA를 분리합니다.
    1. 0.2 mL의 클로로포름을 균질화에 넣고 튜브를 단단히 덮고, 튜브를 15초 동안 힘차게 흔들고, 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
    2. 샘플을 4°C에서 15분 동안 12,000 x g에서 원심분리하고 무색 상부 수성 상을 신선한 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 샘플은 원심분리 후 3단계로 나뉩습니다.
    3. 수성 상에 0.5 mL의 이소프로필 알코올을 추가하고, 활발하게 손으로 튜브를 흔들고, 10 분 동안 실온에서 혼합물을 배양하십시오.
    4. 혼합물을 4°C에서 10분 동안 12,000 x g에서 원심분리하고 상류를 제거한다.
    5. RNA 펠릿을 1 mL의 75% 에탄올로 한 번 세척한 다음 4°C에서 5분 동안 7,500 x g에서 원심분리를 합니다.
    6. 1.2.5단계를 반복합니다.
    7. 펠렛을 5-10분 동안 건조시키고 디에틸피로카보네이트(DEPC)에서 RNA를 분해하여 위아래로 파이프팅한 다음, 마이크로 분광광도계로 총 RNA 농도를 측정하였다(재료 표참조).

2. 상보DNA (cDNA)28합성

  1. 키트를 사용하여 cDNA의 첫 번째 가닥을 합성합니다(재료 표참조). 표 1에 나타낸 바와 같이 20 μL 반응 시스템을 설정하고 42°C에서 50분 동안 PCR 계측기에서 반응 튜브를 인큐베이션한 다음, 5분 동안 85°C에서 반응을 종료한 다음, 향후 유전자 증폭을 위해 -20°C에서 반응 생성물저장한다.
시약볼륨
dNTP 믹스, 2.5mM 각4.0 μL
프라이머 믹스2.0 μL
RNA 템플릿1.0 μg
역전사 버퍼, 5×4.0 μL
역전사, 200 U/μL1.0 μL
RNase 프리 H2O최대 20.0 μL

표 1: 총 RNA를 cDNA로 역전사

3. 재조합 플라스미드생성 29

  1. 디자인 PCR 프라이머.
    1. GenBank 데이터베이스에서 얻은 주요 효소 유전자의 서열을 기반으로 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 PCR 프라이머를 설계하고 회사에서 프라이머를 합성합니다(재료 표참조). 프라이머의 5' 말단에서, 제한 효소 부위(예를 들어, 이 프로토콜에서 BamHI 또는 EcoRI)를 추가한다.
      참고: 이 연구에 사용된 프라이머는 표2에 나와 있습니다.
시퀀스, 5' → 3'목적
AA개치크ATGGCTCCAGGAACTTTGACT애기장대에서 Atf3h 유전자의 PCR 증폭을 위한 전방 프라이머탈리아나. 밤 (것)밤 HI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착됩니다.
AA가트CCTAAGCGAAGATTTCGAA. 탈리아나로부터 Atf3h 유전자의 PCR 증폭을 위한 역프라이머. 에코 (것)에 RI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착된다.
AAGGATCCATGGAGGTCGAAGAGTCCA. 탈리아나로부터 Atfls1 유전자의 PCR 증폭을 위한 전진 프라이머. 밤 (것)밤 HI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착됩니다.
AA가트CTCAATCCAGAGGAGTTTATA. 탈리아나로부터 Atfls1 유전자의 PCR 증폭을 위한 역프라이머. 에코 (것)에 RI 부위는 기울임꼴로 pET32a(+)로 복제하기 위해 부착된다.

표 2: 현재 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머

  1. 유전자를 원핵발현 벡터로 복제한다.
    1. 고충실도 DNA 폴리머라제(물질 표참조)를 사용하여 합성된 cDNA의 첫 번째 가닥으로부터 유전자를 증폭시다. 표 3에 나타낸 바와 같이 100 μL PCR 반응 시스템을 설정하고 다음 PCR 주기를 실행한다: 초기 변성동안 2분 동안 94°C; 그런 다음 변성용 30s에 대해 94°C의 35 사이클, 어닐링을 위한 2분 동안 55°C, 연장을 위한 1분 동안 72°C; 이어서 72°C에서 10분간 최종 연신후. 반응 혼합물을 12°C로 냉각시.
      참고: 연장 시간은 가변적이며 대부분의 DNA 폴리머라제에 대해 분당 약 1000염의 중합을 가진 유전자 길이에 의해 결정된다.
    2. 1% 아가로즈 겔상에 PCR 제품(가장 일반적으로 5 μL)을 시각화하고 DNA 정화 키트를 사용하여 나머지 제품으로부터 특정 DNA 단편을 정화합니다(재료 표참조).
    3. 정제된 DNA 단편 및 벡터(예를 들어, pET-32a(+))를 제한 효소(예를 들어, 이 프로토콜에서 BamHI 또는 EcoRI)로 소화한다. 표 4에 나타낸 바와 같이 0.2 mL PCR 튜브에 50 μL 반응 시스템을 설치하고 37°C에서 37°C에서 3시간 동안 혼합물을 배양하였다.
    4. 겔 추출 키트를 사용하여 DNA 밴드를 회수합니다(재료 표참조). DNA 정화 키트(재료 표참조)를 사용하여 DNA를 정화한 다음 미세 분광광도계로 DNA 농도를 측정합니다(재료 표참조).
    5. T4 DNA 리가아제(물질 표참조)를 사용하여 유전자 단편을 선형화된 벡터 DNA로 리게이트한다. 표 5에 나타낸 바와 같이 1.5 mL 튜브에 결찰 반응을 설정하고 2-3시간 동안 실온에서 튜브를 인큐베이션한다.
      참고: 벡터에 대한 인서트가 있는 몰 비율은 가변적이며 3:1에서 10:1 사이입니다.
    6. 2.5 μL의 결찰 혼합물을 화학적으로 유능한 대장균 세포 (예 : TOP10 또는 DH5α)의 50 μL에 넣고 부드럽게 혼합하고 30 분 동안 얼음에 튜브를 유지하십시오.
    7. 항생제없이 액체 LB 배지 200 μL을 튜브에 넣고 1 시간 동안 220 rpm에서 37 °C 셰이커에서 튜브를 배양하십시오.
시약볼륨
퍼 마스터 믹스, 2×50.0 μL
포워드 프라이머, 10 μM4.0 μL
리버스 프라이머, 10 μM4.0 μL
Cdna2.0 μL
H2O40.0 μL

표 3: PCR 반응 시스템 설정

시약볼륨
DNA 조각/벡터3.0 μg
밤 (것)밤 안녕1.0 μL
에코 (것)에 Ri1.0 μL
컷스마트 버퍼, 10×5.0 μL
H2O최대 50.0 μL

표 4: DNA 단편/벡터의 이중 소화

시약볼륨
삽입X μL (0.09 pmol)
벡터Y μL (0.03 pmol)
결찰 버퍼, 10×1.0 μL
T4 DNA 리가제, 400 U/μL1.0 μL
H2O최대 10.0 μL

표 5: 유전자 단편을 선형화된 벡터로 결찰

  1. 화면 긍정적 인 식민지.
    1. LB 플레이트로부터 단일 콜로니를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지의 200 μL로 접종하고 37°C에서 배양하고, 2-3시간 동안 250 rpm에서 배양한다.
      참고 : 일반적으로 긍정적 인 식민지를 선별하기 위해 4 - 8 개의 식민지를 선택하십시오.
    2. 3.2.1단계에서와 유사한 10 μL 콜로니 PCR 반응을 설정한다.
      참고: cDNA 템플릿 1 μL 대신 LB 배양 1 μL을 사용하십시오.
    3. 1% 아가로즈 젤로 PCR 제품을 시각화합니다. 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 3 mL의 액체 LB 배지로 양수 결과를 내고 14-16시간 동안 250 rpm에서 37°C 셰이커로 인큐베이션한다.
    4. 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 재조합 대장균 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다(재료표 참조).
    5. 이중 제한 효소 분석(예를 들어, 이 프로토콜에서 BamHI 및 EcoRI)에 의해 정제된 재조합 플라스미드를 식별한다. 3.2.3단계에서와 유사한 10 μL 반응 시스템을 설정하고, 이어서 37°C에서 37°C에서 3시간 동안 배양한 후, 1% 아가로즈 겔상에서 재조합 플라스미드로부터 방출된 특정 밴드를 시각화한다.
  2. 양성 재조합 플라스미드의 서열을 확인합니다.
    1. 시퀀싱을 위해 플라스미드를 회사에 보냅니다. DNA 서열 분석 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 시퀀싱 회사에서 얻은 서열과 GenBank 데이터베이스로부터 얻은 기준 서열을 비교하여 결과를 분석합니다.

4. 재조합 효소 단백질30분 분급

  1. 올바른 재조합 플라스미드를 유능한 대장균 BL21(DE3)으로 변환합니다.
    1. 얼음에 1.5 mL 튜브에 유능한 대장균 BL21 (DE3)의 10 μL에 플라스미드의 0.1 μL을 추가하고 5 분 동안 얼음에 튜브를 유지합니다.
    2. 세포를 42°C 수조에서 90초 동안 가열하고 다시 얼음위에 2분 동안 놓습니다.
    3. 항생제 없이 LB 액상 배지 200 μL을 넣고 220 rpm에서 37°C 셰이커에 5분 동안 배양합니다.
    4. 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트상에 50 μL의 변형을 확산시키고 37°C 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 배양하였다.
  2. 유전자의 발현을 유도한다.
    1. 플레이트에서 3-5개의 콜로니를 100 μg/mL 의 증폭기와 함께 LB 액상 배지 3 mL를 함유하는 튜브로 접종하고 37°C 셰이커에서 밤새 250 rpm에서 배양합니다.
    2. 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 액상 배지의 300 mL로 밤새 배양된 모든 배양을 37°C 쉐이커에서 250 rpm에서 배양하여 600 nm에서 배양물의 광학 밀도가 0.4-0.6 사이가 될 때까지 배양한다.
    3. 이소프로필 β-D-티오갈라크토사이드(IPTG)를 0.2 mM의 최종 농도로 배양내로 넣고 3시간 동안 250 rpm, 20-22°C에서 유전자의 발현을 유도한다.

5. 재조합 효소 단백질 을 정화31

  1. 4°C, 12,000 x g에서 배양된 배양물의 원심분리에 의해 박테리아를 10분 동안 수확한다.
  2. 0.1% 트리톤 X-100을 함유한 세균용 용해 완충액 15 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 1 μg/mL 아프로틴, 1 μg/mL leupeptin, 및 50 mM Tris-Cl (pH 8.0)에서 1 μg/mL 펩스타틴.
  3. 세균 현탁액을 초음파 처리하여 재조합 효소 단백질을 방출하고, 이어서 10분 동안 13,000 x g, 4°C에서 원심분리를 실시한다.
  4. 1.5 mL 튜브에서 1.5 mL 튜브에서 상류를 수확하고 알리쿼트하여 향후 사용을 위해 -70 °C에 보관하십시오.
  5. 재사용 가능한 빈 친화열에 500 μL의 태그 정화 수지(재료 표참조)를 적용합니다. 수지5 베드 볼륨의 탈이온수로 수지세척하여 스톡 용액에 에탄올을 폐기한다. 트리스-Cl(20 mM, pH 7.9), 이미다졸(10 mM), 및 NaCl(0.5 M)을 포함하는 결합 완충제의 10개의 베드 부피와 수지의 균형을 조정한다.
  6. 5.4단계에서 상급물의 4 mL를 상기 수지의 슬러리에 적용하고 스토퍼로 컬럼의 2단을 차단한다.
  7. 혼합물을 2 시간 동안 저속으로 회전자상에서 4 °C에서 배양합니다.
  8. 용출 전에 1 mL/min의 유량으로 4°C에서 결합 완충액의 15베드 부피로 융합 단백질 결합 수지세척.
  9. 용출 완충액 500 μL(20 mM Tris-Cl (pH 7.9), 500 mM imidazole, 0.5 M NaCl 포함)을 컬럼에 넣고 10 분 동안 낮은 속도로 로터에 4 °C에서 슬러리를 배양합니다.
  10. 5.5단계를 4번 더 반복합니다.
  11. 수지의 탈이온수 10개, 침대 부피 20% 에탄올 3개로 순차적으로 세척합니다. 수지 20% 에탄올에 담그세요. 스토퍼로 컬럼을 차단하고 4°C에 보관하십시오.
  12. 브래드포드 단백질 분석에 의해 정제된 단백질의 농도를 측정합니다. 10% SDS-PAGE 겔상에서 단백질의 순도를 결정하고 쿠마시 블루 염색 분석으로 밴드를 시각화하였다.
  13. 정제된 단백질 용액에 글리세롤을 10%의 최종 농도로 첨가하여 효소 활성을 안정화시다. 알리쿼트 및 -80 °C에 저장합니다.

6. 시험관 내 이효소 합성 계통16에서 플라바놀에서 플라보놀 을 생성

  1. 버퍼를 준비합니다.
    1. 200 mM Tris-HCl (pH 7.2), 16.4 mM α-케토 글루타릭 산, 0.8 % 아스코르브 산 및 20 % 글리세롤로 구성된 황산 철없이 2 x 합성 버퍼를 만듭니다. 트리스 베이스 1.938 g, 아스코르바테 나트륨 0.640 g, α-케토글루타산 0.250 g, 글리세롤 16 mL을 탈이온수 64 mL에 용해하십시오. 산(HCl)으로 pH를 7.2로 조정하고 최대 80 mL의 탈이온수를 추가합니다. 버퍼를 4°C에 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.
    2. 2 mM 황산염의 100x 재고 솔루션을 확인합니다. 탈이온수 50 mL에 55.6 mg의 황산염 헵타하이드레이트를 녹이고 저어서 최대 100 mL까지 물을 추가하십시오.
    3. 25mM 플라보노이드의 재고 솔루션을 만드십시오. 메탄올에 플라보노이드를 완전히 녹여 -20 °C에서 보관하십시오.
  2. 플라바네에서 플라보놀을 생산하는 합성 시스템을 설정합니다.
    1. 표6에 나타낸 바와 같이 합성 시스템을 준비한다.
    2. 600 rpm (흔들리는 열 블록에서)에서 열린 2.0 mL 튜브에서 40 °C에서 40 분 동안 반응을 배양합니다.
    3. 아세트산 10 μL과 에틸 아세테이트 100 μL을 첨가하여 반응을 종료합니다.
    4. 2시간 후, 유기상을 1.5mL 튜브로 옮겨 실온에서 후드에서 공기 건조를 한다.
시약볼륨
2 × 철 황산염없는 합성 버퍼50.0 μL
25 mM 플라보놀2.0 μL
황산철 2m0.5 μL
1 mg/mL AtF3H2.5 μL
1 mg/mL AtFLS12.5 μL
25 mM 플라바네2.0 μL
H2O최대 100.0 μL

표 6: 이 프로토콜에 사용되는 합성 시스템입니다.

7. 반응 제품 분석

  1. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 분석.
    1. 6.2.4단계에서 플라보노이드 샘플의 5튜브를 풀하고 공기 건조를 위해 300 μL을 꺼냅니다. 메탄올 160 μL에서 플라보노이드 분말을 다시 용해시. 메탄올에 12.5, 25, 50, 100 및 200 ng/μL의 직렬 농도로 정통 플라보노이드 샘플을 준비합니다. 반응 샘플과 정통 플라보노이드 샘플의 1 μL을 폴리아미드 6 플레이트에 로드합니다.
    2. 5.0:1.5:1.0:0.0.5의 비율로 클로로폼/메탄올/에틸 아세테이트/포름산을 포함하는 용매 시스템에서 시료 로드 플레이트를 실행합니다.
    3. 접시를 실온에서 건조시면 됩니다. 알루미늄 염화물 (AlCl 3)의 1 % 에타놀릭 용액으로 플레이트를 스프레이 한 다음 실온에서 다시 공기 건조하십시오.
    4. 30 분 후, 254 nm에서 UV 빛 아래 판의 반점을 시각화하고 이미지를.
    5. 이미지 처리 소프트웨어(예: 이 프로토콜의 ImageJ v1.51j8)를 사용하여 이미지의 각 지점의 회색 값을 분석합니다.
      1. 소프트웨어 ImageJ를 엽니다. 파일 > 열림을 클릭하여 분석할 이미지를 엽니다.
      2. ImageJ 사용자 인터페이스에서 왼쪽에 있는 대부분의 Rectang형 선택 도구를 클릭합니다. 마우스로 이미지의 관심 영역(ROI)을 간략하게 설명하고 눌러 figure-protocol-1 첫 번째 ROI에 레이블을 지정합니다.
      3. 마우스로 직사각형 선택을 다음 ROI로 바로 이동하고 figure-protocol-2 눌러 두 번째 ROI에 레이블을 지정합니다.
      4. 이전 단계를 반복하여 다른 모든 ROI에 레이블을 지정합니다.
      5. 팝업 figure-protocol-3 창에서 모든 ROI에 대한 프로파일 플롯을 생성하려면 누릅니다.
        참고: 현재 ImageJ 사용자 인터페이스의 직선 선택 도구가 자동으로 활성화됩니다.
      6. 직선 선택 도구를 사용하여 관심 있는 각 피크에 대해 닫힌 영역을 정의할 수 있도록 기준선을 그립니다.
      7. ImageJ 사용자 인터페이스에서 해당 아이콘을 클릭하여 지팡이 도구를 활성화합니다. 피크 내부를 클릭하여 팝업 창의 모든 피크에 대한 결과를 표시합니다.
    6. 7.1.1.1 단계에서 해당 플라보노이드 농도에 대해 7.1.5.7 단계에서 회색 값을 플로팅하여 정통 플라보노이드의 TLC 기반 표준 곡선을 만듭니다. 이어서, 생성된 수식에 따라 이 프로토콜에서 생성된 관심의 플라보노이드의 수율을 계산한다.
  2. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS) 분석
    1. 7.1.1 단계에서 0.45 μm 및 0.22 μm 필터를 통해 순차적으로 샘플을 처리합니다.
    2. 샘플을 HPLC/LC/MS 시스템에 로드하고(재료 표참조) C18(4.6 × 150 mm; 즉, 5 μm) 컬럼을 사용하여 샘플을 30°C에서 분리합니다. 물에서 10 - 85 % (v / v) 아세토니트릴 (ACN)의 그라데이션으로 1.0 mL / min에서 열을 엘라우트 (0 - 10 분, 10 - 25% ACN; 10 - 35분, 25 - 50% ACN; 35 - 45분, 50 - 85% ACN; 45 - 50분, 85- 10% ACN; 50 - 60분 , 10% ACN) 200~ 800 nm에서 용루액의 흡광도를 모니터링한다. 300°C에서 10L/min의 건조 질소 흐름과 250°C에서 7L/min의 시스 가스 흐름을 가진 음의 이온 모드에서 LC/MS 분석을 수행하고 내장 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집합니다(재료 표참조).
    3. 단일 파장 크로마토그래프를 추출하여 소프트웨어를 사용하여 반응 샘플 및 정통 플라보노이드 화합물의 피크 영역을 계산합니다(재료 표참조).
      1. 정성적 분석 프로그램을 열고 파일 > 데이터 파일 열기를 클릭합니다. 데이터 파일 열기 창에서 분석할 파일을 선택하고 열기를 클릭하여 파일을 엽니다.
      2. 크로마토그램 R에서 마우스를 마우스오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 팝업 메뉴에서 Extract Chromatograms를 클릭합니다.
      3. E xtract Chromatogram대화 상자를 엽니다. 유형 목록에서 다른 크로마토그램을클릭합니다. 검출기 콤보 상자에서 DAD1을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 HPLC 결과를 Chromatogram 결과 창에 표시합니다.
      4. Chromatogram 결과 창 의 상단에 도킹 된 M연간 Integration 아이콘을 클릭합니다. 마우스와의 수동 통합 해석에 필요한 피크에 대한 기준선을 그립니다.
      5. [보기> 통합 피크 목록]을 클릭하여 결과를 표시합니다.
    4. 7.2.1 단계에서 해당 플라보노이드 농도에 대해 7.2.3.5 단계에서 피크 영역을 플로팅하여 정통 플라보노이드의 HPLC 기반 표준 곡선을 만듭니다. 이어서, 생성된 수식에 따라 이 프로토콜에서 생성된 관심의 플라보노이드의 수율을 계산한다.
    5. 소프트웨어를 사용하여 플라보노이드 화합물의 정확한 질량에 대한 MS 데이터를 분석합니다(재료 표참조).
      1. 7.2.3.1 - 7.2.3.3 단계를 반복합니다.
      2. Chromatogram 결과 도구 모음에서 범위 선택 아이콘을 클릭합니다.
      3. 관심 있는 피크를 선택합니다. 선택한 범위에서 마우스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 팝업 메뉴에서 MS 스펙트럼 추출을 클릭하여 결과를 MS 스펙트럼 결과 창에 표시합니다.

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결과

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F3H 및 FLS1은 도1에 도시된 바와 같이 식물에서 플라바놀로 플라바놀을 변환하는 데 중요한 두 가지 중요한 효소이다. 플라바논으로부터 플라보놀을 제조하기 위한 생체외 생합성 시스템을 개발하기 위해, Atf3h(GenBank 수탁 없음. NM_114983.3) 및 Atfls1(GenBank 가입 없음) NM_120951.3) 유전자는 4주된 A. 탈리아나의 묘목으로부터 원핵발현 벡터 pET-32a(+)로 복제하였다. 재조합 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)으로 변형시키고 융합 단백질을 IPTG 유도 후 발현하고, Ni-IDA 아가로즈 수지를 사용하여 정제하였다. 도2에 도시된 바와 같이, 정제된 융합 단백질은 10% SDS-PAGE 겔상에 95% 이상의 고순도를 나타내었으며, 이는 시험관내 비엔...

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토론

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많은 연구가 건강 관리 및 식품 산업에서 잠재적 인 응용 프로그램으로 인해 플라보놀의 유도에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 유기 용매와 화학 합성을 사용하여 기존의 식물 추출은 플라보놀의 생산에 사용을 제한 본질적인 단점을 가지고. 여기서, 우리는 시험관 내 비엔자이체 캐스케이드를 확립하여 한 냄비에 플라바놀로부터 플라보놀을 제조하는 상세한 방법을 보고한다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 높은 활동과 순수한 재조합 효소를 얻고 2) 원 팟 비엔자이체 반응 캐스케이드를 확립. 일반적으로 말하자면, 박테리아에서 식물 유래 유전자의 발현은 효소 활성의 손실로 이어질 것이다 포함 몸을 형성하는 것을 선호합니다. 우리가 알다시피, TrxA 및 SUMO와 같은 몇몇 펩티드는 박테리아16에서발현되는 재조합 단백질의 발현 및 용해도를 향상시키는 데 도움이 됩니다. 따라서, pET-32a(+) 및 pET SUMO(단계 3.2.3)와 같은 이러한 발현 태그를 포함하는 플라스미드...

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공개 사항

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저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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이 사업은 양주대학교 특별임명교수 창업기금, 장쑤특별교수 창업기금, 장쑤성 6대 인재피크 프로젝트(Grant No. 2014-SWYY-016) 및 기금 지원 사업으로 재정적으로 지원되었다. 강수 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발 (수의학). 우리는 HPLC및 플라보노이드의 MS 분석을 위한 양저우 대학의 시험 센터에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2&시간; Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717A
Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS 시스템을 이용한 고충실도 Agilent 1200 Series RRLC system을 이용한Agilent Technologies, IncN/Aan equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)Agilent Technologies, IncN/AAgilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS 시스템 디하이드로캠페롤이 있는 Agilent 1200 시리즈 RRLC 시스템에서 데이터를 수집하기 위한 소프트웨어
, Sigma-Aldrich Co., LLC91216에서 캠페롤을 생산하기 위한 중간 제품
, 쓰촨성 표준 물질 센터, 중국 약초를 위한 표준 물질 센터PCS0371에리오딕티올에서 케르세틴을 생산하기 위한 중간 제품
DNA 클린업 키트Beijing CoWin Biotech Co., LtdPCR 증폭 또는 겔 정제 DNACW2301
퀘르세틴B21160
Escherichia coli< / em> BL21 (DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809표적 유전자 발현을위한 박테리아 균주
Escherichia coli< / em> DH5 αBeijing CoWin Biotech Co., Ltd스미드 증식을 위한CW0808
FreeZone 1 리터 벤치탑 동결 건조 시스템Labconco Corporation7740020 유기 용매에 용해된 플라보노이드의 동결 건조 장비
겔 추출 키트Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302아가로스 겔로부터 DNA 밴드 정제
겔 이미징 시스템상하이 타논 사이언스 & 기술 Co. 주식 회사.Tanon-
2500		, 폴리아미드 TLC 플레이트의 아가로스 겔 또는 플라보노이드 반점의 DNA 밴드를 시각화하는 장비
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co., LLCPLN350-1KT플라스미드
캠페롤Sigma-Aldrich Co., LLC60010최종 반응 생성물 및 표준 물질
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)Agilent Technologies, IncN/A: HPLC/LC/MS 데이터 분석을 위한 소프트웨어
NanoDrop, Microvolume UV-Vis 분광 광도계, Thermo Fisher ScientificND-8000-GL, DNA/RNA 농도 측정을 위한 장비
나린제닌Sigma-Aldrich Co., LLCN5893kaempferol
Ni-IDA Agarose 수지Beijing CoWin, Biotech Co., LtdCW0010His-tagged fusion proteins
pET-32a(+)Novagen69015-3plasmid for cloning and expressing target genes
플라스미드 염기서열GENEWIZ Suzhou조합 플라스미드N/A
GENEWIZ SuzhouN/Asynthesis of PCR primers
quercetinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.Q111273최종 반응 생성물 및 표준 물질
SuperRT cDNA Synthesis KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741에서 cDNA의 첫 번째 가닥 합성
Thermo Fisher ScientificEL0016선형 벡터 DNA에 삽입물의 접합
TrizolThermo Fisher Scientific15596018총 RNA 분리
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099PCR 프라이머 설계 및 DNA 염기서열 분석을 위한 소프트웨어
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/AHPLC 데이터 분석을 위한 소프트웨어
유전자의 PCR 증폭 , 나린제닌 디하이드로케르세틴eriodictyol Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.의 정제 생산을위한 기질 플라 박테리아 균주, , , 의 minipreparation , , , , , 생산용 기판, , 분석 재프라이머 합성 sequencing 총 RNA T4 DNA 리가아제

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