방법 논문

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DOI:

10.3791/59341

⸱

2019년 3월 31일

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Chemistry, Christopher Newport University

이 논문에서

요약

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여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.

초록

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DNA 젤 전기 이동 법은 agarose를 사용 하 여 크기에 의해 DNA 파편의 분리를 수 분자 생물학 실험실에서 일반적인 도구입니다. 분리 후 DNA 얼룩에 의해 시각 이다. 이 문서에서는 thiazole 주황색 얼룩을 DNA를 사용 하는 방법을 보여 줍니다. Thiazole 오렌지 비교 호의 일반적인 착 방법, 그것은, 저렴 한, UV 또는 파란 빛 (손상을 방지 하기 위해 샘플), 고르기 민감하고 ethidium 평범한 사람 보다 안전 합니다. 이미 DNA 전기 영동 실험 ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 실행을 갖추고 실험실 일반적으로 자외선을 사용 하 여 검색에 대 한 기존 프로토콜을 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다. 블루 빛 감지 샘플의 손상을 방지 하려면 블루 빛 소스와 배출 필터 또한 얻을 수 있습니다. 이미 블루 빛 감지 장비 실험실 단순히 기존 프로토콜 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다.

서론

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이 방법의 목적은 agarose 젤 형광 탐지 thiazole 오렌지 (을)를 사용 하 여 DNA를 식별 하는 것입니다. 그것의 저가 및 유리한 안전 프로필로 인해 thiazole 오렌지 학부 교육 연구소 및 분자 생물학, 특히 ligations 및 복제를 수행 하는 연구 실험실에서 특정 혜택을 볼 수 있습니다.

Ethidium 평범한 사람 agarose 젤에서 DNA의 검출에 대 한 가장 일반적인 염료 남아 있습니다. 이 매우 저렴 하 게 얻을 수 있습니다 때문에 주로 하며만 자외선과 여기 검색. 두 ethidium 평범한 사람 및 thiazole 오렌지 낮은 검출 한계 (1-2 ng/레인)1비싼 되지 않습니다. 그러나 Thiazole 오렌지 시 향상 ethidium 평범한 사람,,에 두 가지 주요 단점이 있다.

첫째, ethidium 평범한 사람은 특수 처리, 운송, 및 처리 요구 사항, 돌연2 thiazole 오렌지는 덜 돌연변이 (3-4 x 덜 Ames 시험에서 변이 원 성)3,4 와 일반적으로 삭....

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프로토콜

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1. 젤을 준비

: 일반 젤 전기 이동 법 프로토콜에 대 한 참고 또한 P.Y.이, 외 알. 14.

  1. Agarose를 혼합 (~ 1 %w / v, 비율 특정 크기 분판 변화 될 수 있다) 버퍼 (미니 젤 (8 x 7 cm) 약 70 mL). 버퍼는 일반적으로 태 (40 mM Tris, 20mm 아세테이트, 트리 스-아세테이트-EDTA, 1 m m EDTA, pH 약 8.6) 또는 TBE (90mm 트리 스, 90mm borate, 트리 스-borate-EDTA, 2 m m EDTA, pH 약 8.3))입니다.
  2. 1.3 μ g/mL의 최종 농도에 thiazole 오렌지를 추가 합니다.
    1. Thiazole 10000 x 재고 솔루션 (13 mg/mL) DMSO에 오렌지를 분해. 특히 빛에 민감한, 동안에 사용 중인 어두운 때에 저장 합니다. 이 솔루션에 대 한 실내 온도에 안정 되어 ~ 개월; 장기 저장 aliquots (DMSO 표준 냉장고에서 얼어) 동결에 의해 달성 될 수 있습니다. 완전히 녹기 하 고 사용 하기 전에 냉동된 솔루션 resuspend 해야 합니다.
      참고: 젤 또한 얼룩이 질 수 있다를 가진 전기 이동 법 후 (단계 2.....

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결과

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Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 사용 하지 않고 고 DNA 손상 자외선을 사용 하지 않고 DNA의 검색을 수 있습니다. Ethidium 평범한 사람은 변이 원 성, 되 고 그래서 실험실에서 그것을 제거 하는 유리한 수 있습니다. UV 빛 DNA를 손상 하 고 파란 빛은 DNA를 손상 하지 않습니다 반면 크게, 변환 효율을 낮춘 다. 검출 한계는 ethidium 평범한 사람, thiazole 오렌지, 일반적인, 파랑-빛-감지 상업 DNA 염색 유사 (그림 1, 테이블의 자료를 참조), ~ 1-2 되 고 모든 3 개의 염료에 대 한 검색 제한 ng/레인 미니 젤 1.

금지 효소 소화 밴드 절단 등 일반적인 응용 프로그램, thiazole 오렌지는 특히 잘 적합 합니다. 블루 빛 여기 DNA의 검출은 강력 하 고 간단 합니다, 그리고 과학.......

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토론

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Ethidium 평범한 사람은 오랫동안 알려진된 독성에도 불구 하 고 분자 생물학 실험실에서 표준 도구. 그것은 또한 요구로 감지 되 고 DNA를 손상 자외선에서 겪고 있다. Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람 뿐만 아니라 유용 하지만 비싼 상업용 염료는 저렴 한 대안을 제공합니다.

Thiazole 오렌지의 혜택은 따라서 두 배. 첫째, thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 교체로 간단 하 게 사용할 수 있습니다. 젤에 얼룩 (1.2 단계)으로 대체 된 EtBr을 동일 하 게 준비 될 수 있습니다. 검출 한계는 유사한 (1 ~ 2 ng/레인)1. 추가 장비는 thiazole 오렌지 EtBr 처럼 UV 빛 (3 단계)으로 검출 될 수 있다 때문에 염료를 전환 해야 합니다. 그러나 자외선에 노출 빠르게 손상 DNA,, 그리고 결 찰 및 변환1등 다운스트림 실험의 실패.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 작품은 크리스토퍼 뉴포트 대학에서 TDG에 시작 기금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-log DNA ladderNew England BiolabsN0469S
Agarose (유전자 분석 등급)FisherBP1356-100
블루라이트 손전등WAYLLSHINE (아마존)WAYLLSHINE 확장 가능한 파란색 LED
ChemiDoc MPBiorad1708280
DMSOSigma-AldrichD8418
에티듐 브로마이드FisherBP1302-10비교를 위해
프로토콜 젤 장치(Owl Easy Cast)Thermo ScientificB1A
Qiagen Qiaquick 젤 추출 키트Qiagen28704
Safe Imager Viewing GlassesInvitrogenS37103블루라이트 사용에 필요합니다.*
SafeImager 2.0(블루라이트 투과광기)InvitrogenG6600블루라이트 플래시라이트는 대체품으로 사용될 수 있습니다
SYBR SafeInvitrogenS33102비교를 위해,
프로토콜 TAE (Tris-Acetate-EDTA)Corning46-010-CM
Thiazole orangeSigma-Aldrich390062
*Invitrogen G6600에는 안경도 포함되어 있습니다
에 필요하지 않음.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
  2. McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N.

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