방법 논문

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

DOI:

10.3791/59391

⸱

2019년 6월 16일

 ,  , 
1Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 3Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 4Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, 5Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, 6Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

이 논문에서

요약

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티로신 질산 단백질의 프로테오믹 프로파일링은 3-니트로티로신 변형의 낮은 풍부성으로 인해 도전적인 기술이었습니다. 여기에서 우리는 모델로 안지오텐신 II를 사용하여 니트로 펩티드 농축 및 프로파일링에 대한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 다른 시험관 내 또는 생체 내 시스템에 대해 확장될 수 있다.

초록

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단백질 질산은 티로신 잔기에서 가장 중요한 번역 후 수정 (PTM) 중 하나이며 진핵 세포에서 반응성 산소 종 (ROS) 및 반응성 질소 종 (RNS)의 화학적 행동에 의해 유도 될 수 있습니다. 단백질에 질산 부위의 정확한 식별은 염증, 노화 및 암과 같은 단백질 질산과 관련된 생리적 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 질화 된 단백질은 유도 된 조건하에서도 세포에서 풍부하지 않으므로 단백질 질산 부위의 프로파일링 및 식별을위한 보편적이고 효율적인 방법이 개발되지 않았습니다. 여기에서 우리는 화학 환원 반응 및 비오틴 라벨링을 사용하여 니트로펩티드 농축을 위한 프로토콜을 설명하고, 그 다음에 고분해능 질량 분광법을 기술합니다. 우리의 방법에서, 니트로 펩티드 유도체는 높은 정확도로 식별 될 수있다. 우리의 방법은 이전에 보고 된 방법에 비해 두 가지 장점을 나타낸다. 첫째, 디메틸 라벨링은 니트로펩타이드의 1차 아민을 차단하는 데 사용되며, 이는 정량적 결과를 생성하는 데 사용될 수 있다. 둘째, NHS-비오틴 시약을 함유하는 이황화 결합이 농축에 사용되며, 이는 질량 분석기상 검출 신호를 향상시키기 위해 더욱 감소되고 알킬화될 수 있다. 이 프로토콜은 현재 논문에서 펩티드 안지오텐신 II 모델에 성공적으로 적용되었다.

서론

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단백질에 티로신 잔기의 질화 형성 3-니트로티로신 많은 생물학적 과정을 조절. 티로신과 3-니트로티로신 사이의 다른 화학적 특성으로 인해, 질산 단백질은 신호작용 활성 1,2를교란시킬 수 있다. 따라서 단백질에서 적화 부위를 효율적으로 풍부하게 하고 식별할 수 있는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 3-니트로티로신은 인산화 및 아세틸화와 같은 다른 형태의 PTM에 비해 단백질에 대한 풍부도가 낮기 때문에 세포주 또는 조직 샘플에서 직접 내인성 질산 부위를 식별하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 니트로펩타이드의 단편화 패턴을 특성화하기 위해 질량 분석법(MS)을 사용하는 방법론(예: Zhan& Desiderio 3)이 개발되어 새로운 질소 변종 방법의 토대를 마련합니다.

현재, MS에 이어 농축 단계는 니트로 펩티드 프로파일링4,5에대한 가장 강력한 전략이다. 보강 방법은 두 클래스로 분류할 수 있습니다. 한 클래스는 3-니트로티로신을 구체적으로 인식할 수 있는 항체를 기반으로 하는 반면....

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프로토콜

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1. 안지오텐신 II의 순화

  1. 질산 펩티드를 생성하기 위해, 390 μL PBS 용액(10 mM NaH2PO 4, 150 mM NaCl,pH 7.4)에서 안지오텐신 II(DRVYIHPF) 모액(물 속에서 2 mM)의 10 μL을 50 μM의 최종 농도에서 희석시켰다.
  2. 안지오텐신 II 용액에 10 μL의 페록시니트라이트(200 mM in 4.7% NaOH)를 첨가하여 5 mM의 최종 농도를 만듭니다.
    참고 : 페록시니트라이트는 불안정하고 산성 형태일 때 쉽게 해결할 수 있으므로 퍼록시니트염의 모액은 기본 용액에 보관되어 -80 °C에 보관됩니다.
  3. 용액의 pH 값을 7-8 로 1 M HCl로 조정합니다. 순화 반응을 시작하려면 튜브를 400 rpm에서 5 분 동안 흔들어줍니다.
  4. 탈염에 대해 시판되는 역상 SPE 열(재료 표참조)을 사용합니다.
    1. 탈염용 용액 2개, 세척을 위한 물에 5% 메탄올, 용출을 위한 물에 80% 메탄올을 준비합니다.
    2. 메탄올 500 μL을 추가한 다음 500 μL의 물을 추가하여 기둥을 사전 컨디셔닝하고, 기둥 상단에 팁이 있는 1mL 파이펫터를 넣고 파이프터를 눌러 흐름을 가속화합니다.
      3. ....

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결과

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이 원고의 니트로펩타이드 프로파일링에 대한 순서도는 그림1에 나와 있습니다. 도2, 도3, 4 및 5는 안지오텐신 II, 니트로-안지오텐신 II, 디메틸 표지된 니트로-안지오텐신 II 및 디메틸 표지된 아미노 안지오텐신 II의 질량 스펙트럼을 각각 보여준다. 화합물의 분자량은 각 도면에서 모노 동위원소 피크의 m/z 값에 의해 반사될 수 있으며, 이는 안지오텐신 II에 대한 화학적 변형이 각 단계에 대해 성공적으로 달성되었음을 나타낸다. 도 6은 LC-MS/MS를 검출하고 특징짓는 4.7단계에서 최종 생성물인 디메틸 라벨링에 의한 니트로펩티드의 정량적 결과를 나타낸다. 빛과 무거운의 상대적인 양은 우리가 다른 그룹에서 농축 된.......

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토론

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여기서 프로토콜은 니트로펩티드 농축 및 프로파일링을 설명합니다. 안지오텐신 II를 모델 펩타이드로 사용하여 그림 1에표시된 절차를 설명했습니다. 니트로-안지오텐신 II를 얻은 후, 펩티드의 1차 아민은 프로토콜 내에서 가장 중요한 단계 중 하나인 추가적인 아민 컨쥬게이션을 피하기 위해 차단되어야 한다. 현재 프로토콜에서, 디메틸 라벨링은 두 가지 이유로 1차 아민을 차단하는 데 사용된다: 첫째, 정량적 결과의 획득을 가능하게 한다; 둘째, 이러한 반응에 대한 비용은 NHS 기반 반응보다 낮고 차단 효율은13이높다. 정량화의 경우, 측정된 광대 무거운 비율은 예상 비율에매우 가깝고(도 7), 오차는 10% 미만으로 계산된다.

프로토콜의 또 다른 중요 한 단계는 디메틸 표지 된 펩 티 드에 3-니트로 티로신의 감소 나트륨 디티오나이에 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 미국 암 학회 기관 연구 보조금 IRG-14-195-01에 의해 지원되었다 (M. 샤론 스택은 주요 조사자입니다; X.L.은 하위 수급자입니다). 이 간행물은 그랜트 번호 KL2 TR002530 및 UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI)의 국립 보건원, 국립 번역 과학 발전 센터, 임상 및 번역 과학 상에서 부분적인 지원으로 가능하게 되었습니다. X. L. 인디애나 CTSI KL2 젊은 구도자 상 수상자입니다. S. F.는 월터 암 재단이 기본 암 보조금을 진행하는 것을 지원하고 있습니다. X. W. 중국 일반 프로그램의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원 됩니다 (그랜트 번호 817773047).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Acclaim pepmap 100 C18 컬럼Thermo-Fisher164534
1M TEAB 솔루션Sigma-AldrichT7408
50% 하이드록실아민Thermo-Fisher90115
아세토니트릴Thermo-FisherA955MS 등급
디티오트레이톨Sigma-Aldrich43819
포름알데히드시그마-알드리치F8775분자생물학 등급
포름알데히드-D2토론토 연구 화학 물질F691353
포름산시그마-알드리치695076ACS 시약
Fusion Lumos 질량 분석기열
이소아세트아미드시그마-알드리치I1149
메탄올써모-피셔A456MS 등급
NHS-S-S-bitionThermo-Fisher21441
오아시스 HLB 컬럼 (10 mg)Waters186000383
peroxynitriteMerck-Millipore516620
sodium cyanoborohydriteSigma-Aldrich42077PhamaGrade
sodium dithionateSigma-Aldrich157953Technical Grade
스트렙타비딘 세파로스GE 힐케어GE17-5113-01
얼티밋 3000 나노LC써모

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
  2. Radi, R. Pr....

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