인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델

요약

이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.

초록

단백질 타우의 변종 응집은 병리학 적으로 알 츠 하이 머 병 (AD)을 비롯 한 다 수의 퇴행 성 신경 질환에 관여 한다. 동종 요법의 마우스 모델은 집계 된 타우의 신경 독성 메커니즘을 조사 하기 위한 귀중 한 자원을 제공 했지만, 신경 생리학의 종 간 차이로 인해 마우스 뇌는 적합 하지 않다는 것이 점차 명백 해지고 있습니다. 인간의 상태 모델링. 세포 배양 방법의 진보는 시험관에서 실험적인 사용을 위해 인간적 인 신경 배양을 접근 하 고 신경 치료제의 발달에 원조 했습니다 만들었습니다. 그러나, 인간 신경 세포 배양의 적응에도 불구 하 고, 인간 타우 병의 시험관 내 모델은 아직 널리 이용 되지 않는다. 이 프로토콜은 인간 뉴런이 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터에 융합 된 병리학 적 돌연변이 타우에 대 한 코드를 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 하는 타우 응집의 셀룰러 모델을 기술 한다. 형질 도입 배양은 thioflavin에 대해 긍정적으로 얼룩을 발생 하는 타우 응집 체를 생산 하 고 신경 독성의 마커를 표시 합니다 (예: 감소 된 축 사 길이 및 증가 된 리소 소 양). 이 절차는 인간적 인 tauopathies를 공부 하기를 위한 유용 하 고 비용 효과적인 모형 일 수 있습니다.

서론

소 세관-관련 단백질 타우의 병리학 적 응집은 AD, 전방 측 두 성 치 매 (FTD), 픽의 질병 및 진보적인 수 아 핵 성 마비 (PSP)¹을 포함 하는 많은 신경 변성 질환의 정의 특징 이다. 질병이 없는 상태에서, 타우는 뉴런 축 삭²에서 미세 구 필 라 멘 트에 결합 하 고 안정화 시킵니다. 그러나, 타우의 질병 관련과 인 산화는 타우 응집을 촉진 하 고, 미세 세관에서 해리 되며, 신경 독성³. 집계 된 tau의 독성 효과는 세포내 칼슘의 장애 조절을 초래 하 고, 최종적으로는 세포 사 멸을 유발 하는 콜린 성⁴ 및 glutamatergic 수용 체의 변종 활성화를 수반할 수 있다. 동물 모델에서, 뇌 타우의 감소는 AD 마우스에서 병리학을 향상⁶ 반복적 인 가벼운 외상 성 뇌 손상의 마우스 모델에서⁷.

장착 증거는 마우스 유래 타우의 구조와 결합 친화도가 인간 유래 타우와 구별 된다는 것을 보여주고, 마우스 타우는 인간 tauopathies 모델링에 부적합 하다⁸. 그러나, 인간 세포 동종 요법 모델은 널리 상업적으로 입수 가능 하지 않다. 이 작업의 전반적인 목표는 인간 뉴런이 돌연변이 인간 타우 컨스트 럭 트⁹를 포함 하는 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 타우 응집의 시험관 내 모델을 기술 하는 것 이다. 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트를 유발 하는 타우 집합체는 yfp 리포터 (타우-wt-yfp)에 융합 된 야생 형 (wt) 타우 반복 도메인에 대 한 대조 군 코드를 생성 하는 반면, 타우 반복 도메인의 품고 P301L 및 V337M 돌연변이에 융합 하는 것 이다. 이 방법을 사용 하 여 형질 도입 신경 배양 물은 nontransduced 문화 보다 약 9 배 더 많은 타우를 표현 한다. 타우 발현의 과다 발현 양은 타우-르 DLM-YFP와 타우 Wt-형질 도입 세포 사이에서 대략적으로 동일 하지만, 타우-RDLM-YFP 디스플레이 응집 체로만 뉴런 형질 도입. 배양 액은 thioflavin 및 시 냅 스 밀도의 표시 감소에 대 한 긍정적 인 형질 도입-YFP 얼룩과 함께 제공 됩니다. 따라서,이 셀룰러 모델은 시험관 내에서 타우 응집을 연구 하기 위한 유용한 도구가 될 수 있다.

프로토콜

1. 미디어 및 시 약의 제조

1. 배양 플레이트에 대 한 지 하 막 매트릭스 코팅을 4°c에서 해 동 (지 하 막 매트릭스를 따뜻하게 하거나 응고 하는 것을 허용 하지 않는다). 1 mL의 알리 쿠오를 만들고-20°c 또는-70 ° c에서 보관 하십시오.
2. 10 µ g/mL에서 멸 균 인산 완충 식 염 액 (PBS)에 기본 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF)를 재구성 하 고 10 µ L 분 취를 만듭니다. 4°c에 보관 하십시오.
3. 미 개봉 500 mL 병 DMEM, 글루타민을 사용 하 여 B27, 5ml(15 ml) 및 페니실린 streptomycin (5ml)을 첨가 하십시오. 이 신경 줄기 세포 (NSC) 매체의 50 mL을 원추형 튜브에 넣고 10 µ L의 10µ을 추가 합니다. NSC (+) bFGF 매체를 4°c에서 보관 한다.
4. (-) BFGF 미디어를 만들려면 1.3 단계에서 설명한 것과 동일한 레시피를 사용 하 되 bFGF 추가 하지 마십시오. 이 매체는 뉴런에 대 한 NSCs를 차별화 하 고 분화 후 신경 배양을 유지 하는 데 사용 됩니다.

2. 렌 티 바이러스 구조

참고: 렌 티 바이러스 구문을 사용 하 여 작업을 시작 하기 전에 실험실에서 생물학적 안전 수준-2(BSL-2) 에이전트를 사용할 수 있도록 승인 되었는지 확인 하십시오. 또한 렌 티 바이러스 벡터로 작업할 때는 BSL-2 배양 후드, 개인 보호구 및 폐기 방법을 사용 해야 합니다.

1. 선호 하는 공급원 으로부터 렌 티 바이러스으로 포장 된 타우 컨스트 럭 트를 구합니다 (구성 정보는 샌 더 스 외.¹⁰ 참조).

3. 인간 신경 줄기 세포 배양

참고: NSCs는 전형적으로 100000-150000 세포/cm² 에서 시 딩 되 고, 시판 되는 대부분의 nscs는 1 x 10⁶ 세포/바이 알로 판매 된다. 이 프로토콜은 10cm 세포 배양 접시에 최적화 되어 있습니다 (다른 크기의 요리가 사용 될 수 있지만). 따라서 상업적으로 입수 가능한 NSCs가 사용 되는 경우, NSCs는 10 cm의 접시를 종자에 충분 한 세포를 초래 하기 위해 6-웰 디쉬에 먼저 배양 됨으로써 확장 될 필요가 있다. 이 프로토콜은 대안적으로 다양 한 세포 배양 접시 크기에 적용 될 수 있다 (그러나 이러한 프로토콜이^11,12의 다른 곳에서 사용 가능 하므로 nscs를 통과 시키기 위한 지침이 포함 되어 있지 않습니다).

1. 세포 배양 플레이트의 제조를 위해, 세포 배양 플레이트에 대 한 동결 된 지 하 막 매트릭스 코팅의 1 개의 취 액을 제거 하 고 4°c에서 해 동 할 수 있게 한다 (앨 리 쿠오 트는 세포가 시 딩 되기 전날 밤새 4°c에서 배치 가능). 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 385 µ L을 DMEM/F12 미디어 + 페니실린 streptomycin에 추가 하십시오.
   참고: DMEM의 5ml/F12 미디어 + 페니실린-streptomycin은 단일 10cm 접시를 코팅 하기에 충분 합니다 (이 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 용액 1 mL은 6 웰 디쉬를 잘 코팅 하기에 충분 합니다). 대안적으로, 세포가 고정 되 고 면역 염색 되거나 thioflavin을 위해 염색 되는 경우, 유리 커버 상의 배양 세포는 24 웰 배양 접시에 슬립 된다.
   1. 미디어와 매트릭스 코팅을 전 및 배양 접시에 추가 하는 동안 차갑게 유지 합니다. 지 하 막 매트릭스 코팅을 배양 접시에 넣고 요리를 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° c)에 넣습니다. 최적의 코팅을 위해 지 하 막 매트릭스를 1 h 이상 또는 미만으로 배양 하지 마십시오. 1 시간 후, 세포 배양 접시에서 지하실 막 매트릭스 코팅을 흡 기. 이것이 도금 될 준비가 된 것이 NSCs와 일치 하는지 확인 하십시오.
      참고: 냉동 주식에서 세포를 해 동 하지 않는 경우, 3.2 단계를 건너 뛰고 단계 3.3.
2. 세포가 동결 된 NSC 주식에서 해 동 되는 경우, 동결 된 세포의 유리병을 취하고 물에서 바이 알을 앞뒤로 이동 하 여 37 ° c로가 열 된 수조에 따뜻하게 합니다. 동결 해제 되 면, 바이 알을 70% 에탄올로 분무 하 여 세포 배양 후드에 넣습니다. 세포를 DMEM의 10 mL/F12 + 페니실린 streptomycin 매체에 전달 하 고 실 온에서 5 분 동안 1000 x g 의 튜브를 원심 분리 합니다. 미디어를 흡 인 하 고 NSC 매체에 있는 세포를 소생 시킵니다.
3. 사용 되 고 있는 세포 배양 용기에 대 한 적절 한 시 딩 밀도를 얻기 위해 NSC 배지에서 세포를 희석 한다.
   참고: 예를 들어, NSCs가 6 웰 플레이트에 도금 되는 경우-6 웰 배양 접시에 한 웰은 9 cm²-90만의 표면적을 가지 며 종자에는 135만 세포가 필요 하다. 따라서, 100만 세포를 함유 하는 1 개의 바이 알은 2 mL의 배지로 재현 탁 수 있으며 6 웰 디쉬의 단일 웰에 첨가 된다.
4. 지 하 멤브레인 매트릭스 코팅 배양 접시 (10만 셀/cm²)를 종자로 NSC 미디어에 부유 하는 충분 한 세포를 추가 하 고 매일 미디어를 변경 (냉동 재고를 사용 하는 경우, 그 이후 매일 도금 후 하루에 미디어를 변경). 80%의 confluent가 될 때까지 세포를 성장.
   참고: 이 세포는 도금 직후에는 80%의 합류에 도달 하 게 될 것 이지만 냉동 주가 사용 되는 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다.
5. 일단 NSCs가 75%-80% confluent가 되 면 NSC (+) bFGF 매체를 제거 하 고 NSC (-) bFGF 매체로 교체 하 여 뉴런 분화를 시작 합니다. 적어도 4 주 동안이 미디어의 세포를 배양 하 여 (매일 미디어 교체).
   참고: 세포는 bFGF의 철수 후에 며칠 동안 계속 해 서 나눌 것입니다; 따라서 세포는 90-100% 합류에 도달 할 수 있습니다. 4 주 동안 배양 한 후, 세포는 신경 운명을 달성 하 고 렌 티 바이러스의 치료를 위한 준비가 될 것입니다.

4. 신경 배양 물의 형질 도입 및 유지

1. 렌 티 바이러스를 사용 하 여 뉴런을 트랜스 코딩 하려면 역가 3.4 x 10 의 변환 가능한 장치/셀 (100% confluent 10 cm 접시에는 ~ 1000만의 뉴런이 포함 됩니다). 세포 배양 배지에서 필요한 농도로 생산 가능한 단위를 희석 하 여 세포에 추가 합니다 (세포 배양 접시에는 정상적인 분량의 배지 사용). 렌 티 바이러스를 첨가 한 후 이틀 후, 신선한 (-) bFGF 배지 (렌 티 바이러스 없이)로 1x 세포를 세척 하 고 평소와 같이 (-) bFGF 배지에서 계속 배양 합니다.
2. 렌 티 바이러스 치료를 위해, 세포 배양 배지를 변경 하 여 형질 도입 뉴런을 먹이 ([-] bFGF 미디어) 매일. 형질 도입 후 8 주 동안 세포를 유지 한다. 생존을 보장 하기 위해 정기적으로 빛 현미경으로 세포를 시각화.
   참고: 스파스 또는 수지상 파손은 세포가 더 이상 실행 가능 하지 않다는 징후입니다.

5. 세포의 이미징

1. 살아있는 세포 화상 진 찰
   1. 형질 도입 후 (렌 티 바이러스의 첨가 후 4 일째), 살아있는 세포 이미징이 가능한 형광 현미경 하에서 YFP 신호를 관찰 한다. 배양 기에서 세포 배양 접시를 꺼내 배양 접시의 상단에 뚜껑을 유지 하 여 문화 우물이 살 균 남아 있는지 확인 합니다. ~ 514 nm의 여기 파장의 10 배 목표와 ~ 527 nm의 방출 필터를 사용 하 여 셀을 시각화 합니다.
      참고: 집계는 일반적으로 형질 도입 세포 배양 물에서 렌 티 바이러스의 적용 후에 6-8 일에 보입니다.
2. 고정 세포 염색 (β-투 불 린 III 라벨링 및 thioflavin 염색)
   1. 파라 포름알데히드 (PFA)의 세포를 고정 하기 위해 유리 커버 슬립에서 자란 형질 도입 뉴런에서 배양 배지를 제거 합니다. PBS로 1x 셀을 세척 하 고 세척을 제거 하 고 µ의 4% PFA (24 웰 플레이트를 사용 하는 경우)를 실내 온도에서 20 분 동안 커버 슬립으로 300~500mb를 추가 하십시오. PFA를 제거 하 고 커버를 PBS로 2 배로 씻으십시오.
   2. PBS, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 및 0.3% 트리톤 X-100으로 구성 된 블로킹 용액을 제조 하였다. 용액의 300 ~ 500 µ L을 웰에 추가 하 고, 4°c에서 2 시간 동안 커버 슬립을 배양 한다. 2 시간 후, 차단 용액에 1 차 항 체 (1:500의 항 체 농도에서)를 희석 하 고 각 웰에 1 차 항 체 용액을 300 ~ 500 µ L을 첨가 한다. 4 ° c에서 밤새 흔들 또는 회전 플랫폼 (저속)에 플레이트를 놓습니다.
   3. 다음날, 1 차 항 체 용액을 제거 하 고 각 PBS로 5 분 동안 커버 슬립 3을 세척 한다. 블로킹 완충 용액에 2 차 항 체를 희석 (1:1000의 농도로) 하 고 각각의 웰에 2 차 항 체 용액을 첨가 한다. YFP 신호와 겹치지 않는 형광 태그를 사용 하 여 적절 한 2 차 항 체를 선택 합니다 (예: CY-3). 흔들 또는 회전 플랫폼에서 2 시간 동안 실 온에서 세포를 배양 합니다. 2 시간 후, 이차 항 체 용액을 제거 하 고 각 PBS로 10 분 동안 커버 슬립 3을 세척 한다.
   4. 이중 탈 이온 수 (DDW)의 커버 슬립을 10 분간 세척 합니다. DDW를 제거 하 고 10 분 동안 50% 에탄올에 0.015% thioflavin 희석 한 300 µ를 추가 합니다. thioflavin 용액을 제거 하 고 4 분 동안 각각 50% 에탄올을 가진 커버 슬립 2 배를 세척 한 후 4 분 30% 에탄올로 세척 하 고 각각 30% 에탄올로 5 분 동안 두 번 세척 합니다. 마운팅 전에 DDW로 커버 슬립을 1x로 씻으십시오.
      참고: 5.2.4 단계에서 설명 된 thioflavin 염색은 선택 사항입니다.
   5. 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착 하려면 유리 슬라이드의 "+" 측면에 하나의 마운팅 미디어를 놓습니다. 유리 커버 슬립이 포함 된 우물에서 모든 액체를 제거 하 고 미세한 집게를 사용 하 여 유리 커버 슬립을 조심 스럽게 제거 하 고 배양 된 세포가 있는 쪽을 추적 합니다.
   6. 커버 슬립의 가장자리를 키 지움에 살짝 눌러 여분의 수 분을 제거 하십시오. 여전히 커버 슬립을 미세 집게로 파지 하 고 커버 슬립의 가장자리 (장착 용지 방울을 향하게 하 여 셀 쪽)를 장착 매체에 터치 한 다음 장착 용지에 커버 슬립을 부드럽게 배치 합니다 (배양 된 셀을 장착 커버와 글래스 슬라이드 사이에 두고 양측). 이미징 하기 전에 마운팅 미디어가 30 분 동안 강화 되도록 하십시오. 슬라이드는 추후 사용을 위해-20°c에 보관할 수 있습니다.
   7. 형광 현미경을 이용 하 여 세포를 이미지 하 고 적절 한 여기/방출 스펙트럼 (yfp = ~ 514/527 nm, CY-thioflavin = 555/568 ~ 390/426 nm).

6. 선택적 방법

1. 2 일 마다 배양 물에서 컨디셔닝 된 배지를 수집 하 고 배양에 의해 방출 된 타우 종의 미래 분석을 위해-20°c에 보관 하십시오.

결과

형질 도입 뉴런은 형광을 YFP로 태깅 하였으며, RDLM-형질 도입 배양은 형질 도입 후 응집 체를 표시 하였다. 이러한 개재 물은 thioflavin을 위해 긍정적으로 염색 되었습니다 (그림 1). 그림 1 에서 알 수 있듯이이 프로토콜은 thioflavin 타우 응집 물을 표시 하는 뉴런 문화를 생성 합니다. 초기 실험의 경우, 신경 세포 분화는 배양 물에서 뉴런 특이 적 마커 β-투 불 린 III를 면역 표지 하 여 확인 하는 것이 좋습니다. 중요 하 게는, 형광으로 태그 된 이차 항 체는 YPF (Cy3 예를 들어)와 겹치지 않는 흥분/방출 스펙트럼을 가져야 합니다. 황색 형광 타우 응집 체는 염색의 부재에서 볼 수 있지만, thioflavin 또한 형광 신호가 타우 및 세포 잔해가 아니라 응집 되어 있음을 확인 하기 위해 이미징에 사용 되어야 한다. 추가적으로, 도 1

토론

이 프로토콜은은-얼룩 양성 응집 체 및 thioflavin 양성 신경 섬유의 엉 킴 (NFTs)을 전시 하는 인간 타우 병의 시험관 내 모델의 생성을 설명 합니다. 더욱이, 형질 도입 세포는 형태학 적 결함, 감소 된 synaptogenesis 및 증가 된 리소 소 부피와 같은 타우-유발 병 리를 표시 한다. 이 프로토콜의 주요 이점은 타우 독성의 분석 뿐만 아니라 약물 스크리닝 연구에 사용 될 수 있는 신경 병 증의 접근 및 비용 효율적인 모델을 제공 한다는 것입니다. 이 모델은 인체 타우 병 세포 주를 아직 널리 사용할 수 없고 마우스 유래 뉴런에서 형질 전환 타우를 사용 하 여 동물 사육이 필요 하 고 신경 세포의 차이로 인해 신경 변성 연구에 필요한 물질을 채 웁 니다. 종 사이의 특성.

위에 나열 된 것 외에도이 절차를 성공적으로 수행 하려면 여러 가지 중요 한 단계가 있습니다. 먼저, 바이러스 성 역가가 너무 낮으면 문화가 응집을 형성 하지 않기 때문에 올바른 바이러스...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 배양 접시	Thermofisher	12556002
15 mL 튜브	Biopioneer	CNT-15
16% 파라포름알데히드	Thermofisher	50-980-487
24 웰 배양 플레이트	Thermofisher	930186
50 mL 튜브	Biopioneer	CNT-50
스프레이 병	에 70% 에탄올다양한 출처	NA
B27 보충제	Thermofisher	17504044
기저막 매트릭스 (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
소 혈청 알부민	Sigma	A7906
세포 배양 인큐베이터	다양한 출처	NA
원심분리기	다양한 공급원	NA
글루타민을 함유한 DMEM-F12 배양 배지	Thermofisher	10565042
에탄올(50% 농도 이상)	다양한 공급원	NA
형광 표지된 2차 항체	다양한 공급원, 실험 의존적	NA
형광 현미경	다양한 공급원	NA
유리 커버 슬립	Thermofisher	1254581
유리 슬라이드	Thermofisher	12-550-15
인간 신경 줄기 세포	다양한 소스	NA
렌티바이러스 벡터	다양한 소스	맞춤형 주문
장착 매체	Thermofisher	P36934
N2 보충제	Thermofisher	17502048
페니실린-스트렙토마이신	Thermofisher	15140122
인산염 완충 식염수	Thermofisher	14190250
1차 항체	다양한 공급원, 실험에 의존하는	NA
로킹 또는 회전 플랫폼	다양한 공급원	NA
멸균 세포 배양 후드	다양한 출처	NA
티오플라빈 S	시그마	T1892-25G
트리톤 X-100	써모피셔	BP151-100
수조	다양한 출처	NA