배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소

요약

여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.

초록

발달 과정에서, 배아는 자신의 신체 크기에 자신의 신체 패턴을 일치 시키는 현저한 능력을 나타낸다; 그들의 신체 비율은 특정 한계 내에서 더 크거나 작은 배아 에서도 유지 됩니다. 이 스케일링 현상은 한 세기 동안 주목을 받고 있지만, 근본적인 메커니즘을 이해 하는 것은 다양 한 크기의 배아에서 발달 역학에 대 한 정량적 인 설명의 부족으로 인해 제한 되었습니다. 이 한계를 극복 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징에 대 한 큰 이점이 zebrafish 배아의 크기를 감소 시키는 새로운 기술을 개발 했습니다. 우리는 별도의 단계에서 blastula 단계에서 세포와 노 른 자의 균형 잡힌 제거 후, 배아는 신속 하 게 올바른 조건에서 회복 하 고 더 작은 하지만 그렇지 않으면 정상적인 배아로 발전 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 특별 한 장비가 필요 하지 않기 때문에 쉽게 적응 할 수 있으며, 형태 적 매개 패터 닝의 견고성을 포함 하 여 광범위 한 스케일링 문제를 연구 하는 데 사용 됩니다.

서론

과학자 들은 배아 크기가 자연 및 실험 조건^1,3에서 크게 다를 수 있지만 태아가 일정 한 신체 비율을 형성 하는 현저한 능력을가지고 있다고 오랫동안 알려져 있다. 이론 및 실험적 연구의 수십 년에도 불구 하 고, 크기 변화에이 견고성, 불리는 스케일링, 그리고 그것의 근본적인 메커니즘은 많은 조직과 기관에서 알 수 없는 남아. 직접 개발 시스템의 역학을 포착 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징⁵에서 큰 이점을가지고 zebrafish⁴에서 재현 가능 하 고 간단한 크기 감소 기술을 확립 했다.

Zebrafish는 발달 생물학을 포함 하 여 생물학의 여러 학문을 연구 하는 동물 모델 척추 동물 역임 했습니다. 특히, 제 브라 피쉬는 생체 내 라이브 이미징 (⁶ ) 때문에 1) 개발이 정상적으로 진행 될 수 있으며 모와 달걀 껍질, 그리고 2) 배아가 투명 하다. 또한, 배아는 일부 온도 및 환경 변동을 견딜 수 있으며,이는 실험실 조건에서 공부 ....

프로토콜

모든 어류 관련 절차는 하버드 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행 하였다.

1. 공구 및 시 약 준비

1. 배아를 잘라 와이어 루프를 확인
   1. 직경 40 μ m의 견고 하 고 부식성이 없는 스테인레스 스틸 와이어 20cm를 사용 하십시오. 와이어를 통해 유리 모 세관 (1.0 mm 외경, 0.5 mm 내경, 필 라 멘 트 없음)을 반복 하 여 상단에 작은 루프를 작성 합니다 (루프 길이는 1.0 mm입니다).
   2. 제자리에 고정 하기 위해 와이어 루프 사이의 유리 모 세관의 끝에 명확한 매니큐어의 약간의 방울을 넣어. 건조 시켜 주세요. 배아를 손상 시킬 수 있으므로 루프 부분에 매니큐어를 주지 않도록 하십시오.
   3. 나무 젓가락 (9 "대나무 일회용 젓가락 반으로 깨진)에 루프와 유리 모 세관을 부착 실험실 테이프를 사용 하 여. 유리 모 세관의 약 2.5 cm 정도를 두고 젓가락을 넘어, 도구 젓가락 부분이 물에 담 그 지 않도록 하십시오. 이 길이를 기본 설정으로 조정 합니다.
2. 또는, 유리 바늘을 만들어 배아를 잘라

결과

노 른 자 부피 감소는 일반적인 형태학을 위해 중요 합니다
최근 알 무에도 카스 티 요 외¹⁷에 기재 된 바와 같이, 배아의 크기 감소는 노 른 자 부피를 감소 시 킴으로써 달성 될 수 있다. 노 른 자 부피 감소와 비교 하기 위해, 우리는 2 단계 장작 패기와 황 반도 (그림 2 와 보조 영화 1)를 모두 수행 했습니다. 2 단계 다진 배아는 발달 단계 전반에 걸쳐 크기 차이를 제외한 대조 군 (dechor이온화만) 배아에 비해 겉보기에 정상적인 전체적인 형태학을 보여 주었다 ( 도 2의 상단 및 중간 패널 참조). 다른 한편으로, blastula만 다진 배아는 특히 초기 단계에서 특이 한 형태를 보였다. 상피 내에서 배아는 수축 하 고 들여쓴 모습 ( 그림 2.......

토론

역사적으로, 척추 동물 동물 들 중에서, 크기 감소는 주로 배아를 수 륙 양용으로 사용 하 여 수행 되었으며, blastula 스테이지 (¹²)에서 동물-식물성 축을 따라 배아를 양분 하였다. 그러나, 우리는 배아를 이등분 때 개구리와 제 브라 피쉬 배아 사이에는 주로 두 가지 차이점이 있습니다. 첫째, 제 브라이 어 배아가 비 대 한 (blastula 단계)의 관용이 되는 단계에서 주최자는 blastula 여백^18,20,²¹의 제한 된 지역에 위치 하 고 있습니다. 배아의 형태에서 주최자의 위치를 알 수 없기 때문에, 무작위로 동물-식물성 축을 따라 배아를 절단 하는 것은도 살자 또는 독 화 된 배아를 생산.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
60mm PYREX 페트리 디쉬	코닝	3160-60
Agarose	affymetrix	75817	라이브 이미징
Agarose, 저겔화 온도 유형 VII-A	SIGMA-ALDRICH	A0701-25G
CaCl2		EMD CX0130-1	1/3 Ringer's solution용
CaSO4			계란 물용
커버 슬립(25mm x 25mm, 두께 1)	CORNING	2845-25
일회용 주걱	VWR	80081-188
폼 보드	ELMER'S	951300	현미경 인큐베이터
용 Forcept (No 55)	FST	11255-20
유리 피펫	VWR	14673-043
HEPES	SIGMA Life Science	H4034	1/3 Ringer의 솔루션
INCUKIT XL 캐비닛 인큐	베이터 용 INCUKIT XL 인큐베이터 Warehouse.com		현미경 인큐베이터용
인스턴트 바다 소금	인스턴트 오션	138510	달걀 물용
KCl	SIGMA-ALDRICH	P4504	1/3 링거 용액용
메틸 셀룰로오스	SIGMA-ALDRICH	M0387-100G
NaCl	SIGMA-ALDRICH	S7653	1/3 링거 용액
페트리 접시	Falcon	351029	용 라이브 이미징을 위한 마운트 만들기
페놀 레드	SIGMA Life Science	P0290
피펫 펌프	BEL-ART PRODUCTS	F37898
Pronase	EMD Millipore Corp	53702-250KU
Tricaine-S (MS222)	WESTERN CHEMICAL INC
초박형 밝은 어닐링 316L 직경 0.035mm 스테인레스 스틸 직조 와이어	Sandra		우리가 사용한 전선은 ~ 20 년 전에 얻은 것인데 정확히 같은 전선을 찾을 수 없었습니다. 이 제품은 우리가 사용하는 것과 동일한 재질과 직경을 가지고 있습니다.