스펙트럼 이미징은 단일 샘플에서 여러 형광 신호를 식별하고 분리하는 신뢰할 수 있는 솔루션이 되었으며 관심 있는 신호를 배경 또는 자동 형광과 쉽게 구분할 수 있습니다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 필요한 이미지 수집 시간을 줄이면서 동시에 신호 대 잡음 비를 증가시킴으로써 이 기술을 향상시킵니다.
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이 논문에서
요약
초록
몇몇 기술은 현상을 확인하거나 연구하거나 기능을 해명하기 위하여 형광 신호의 탐지에 의존합니다. 이러한 형광 신호의 분리는 형광 원이 배경 신호 및 자가 형광 (스펙트럼에 대한 지식을 감안할 때)뿐만 아니라 서로 분리 될 수있는 하이퍼 스펙트럼 이미징의 출현까지 성가신 것으로 입증되었습니다. 서명)을 참조하십시오. 그러나 기존의 방출 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 여기및 방출 광을 필터링하는 데 필요한 필터링으로 인해 수집 시간이 느리고 신호 대 잡음 비가 낮습니다. 이전에는 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징이 필요한 수집 시간을 줄이는 동시에 획득된 데이터의 신호 대 잡음 비를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 상용 장비를 사용하는 이 프로토콜은 단일 샘플에서 여러 형광원으로부터 신호를 분리하기 위해 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 현미경 시스템을 조립, 교정 및 사용하는 방법을 설명합니다. 세포와 조직의 현미경 이미징에 매우 적합하지만, 이 기술은 화학 적 이미징, 환경 응용 프로그램, 안과 치료, 식품 과학, 법의학, 의학 및 광물학.
서론
스펙트럼 이미징은 다양한 방법으로 수행될 수 있으며여러용어1, 2,3,4에의해 지칭된다. 일반적으로 스펙트럼 이미징은 적어도 2개의 공간 치수와 하나의 스펙트럼 차원에서 수집된 데이터를 말합니다. 다중 스펙트럼 및 하이퍼 스펙트럼 이미징은 파장 대역의 수 또는 스펙트럼 밴드가 연속적인지 여부에 따라 가장 자주 구별됩니다 1. 이 어플리케이션의 경우, 하이퍼스펙트럼 데이터는 여기(즉, 5nm)에 사용되는 각 대역통과 필터의 절반 이하의 전체 폭의 절반 이하의 중앙 파장의 간격으로 달성된 연속 파장 대역으로 획득한 스펙트럼 데이터로 정의됩니다. 14-20 nm 대역폭의 밴드패스 필터의 중심 파장 간격). 데이터 대역의 연속적인 특성을 통해 데이터 집합의 오버샘플링을 허용하므로 스펙트럼 도메인을 샘플링할 때 나이퀴스트 기준이 충족됩니다.
하이퍼 스펙트럼 이미징은 첫 번째 위성 위성과 함께 1970 년대와 1980년대에 NASA에 의해 개....
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프로토콜
1. 장치 설정
- 광원: 높은 출력과 높은 충돌(이러한 연구에 300W Xe 아크 램프가 사용)을 가진 광대역 스펙트럼 광원을 선택합니다.
- 셔터(선택 사항): 광학 경로에 셔터를 추가하여 시간 경과 이미징을 위해 광표백을 줄입니다.
- 튜닝 가능한 필터 시스템: 원하는 파장 조절 가능한 여기 범위(예: 360-485 nm)를 가능하게 하는 기계적 튜닝 어셈블리 및 박막 튜닝 필터(TFTF) 세트를 통합합니다.
- 현미경: 전동 이색 필터 포탑 및 컨트롤러를 포함한 반전형광 현미경을 사용한다.
- 형광 필터 큐브: 긴 통과 형광 필터 큐브를 어셈블합니다. 최상의 결과를 얻으려면 동일한 파장에서 이색 거울과 장패스 방출 필터를 선택하여 방출 광(예: 495nm)으로부터 최적의 여기분리를 달성하십시오.
- 목표: 실험에 사용된 파장 범위에 대해 균일한 초점을 보장하기 위해 적절한 apochromatic 목표를 사용합니다(이 연구에 60배 의 물 목표가 사용되었습니다).
- 자동 단계(선택 사항): 이미지 스티칭을 통해 여러 시야 및/또는 매우 큰 필드를 빠르게 샘플링하기 위해 자동화된 단계를 사용합니다. 객원과 카메라로 무대를 보정합니다.
- 카메라: 실험....
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결과
이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 정확하고 이미징 및 스펙트럼 아티팩트가 없는 데이터의 수집을 보장하는 데 필요합니다. 이러한 단계를 건너뛰면 중요한 것처럼 보이지만 다른 스펙트럼 이미징 시스템으로 는 확인하거나 재현할 수 없는 데이터가 생성되어 해당 데이터로 이루어진 결론을 효과적으로 무효화할 수 있습니다. 이러한 중요한 단계 중 가장 중요한 단계는 적절한 스펙트럼 출력 보정(섹션 3)입니다. 보정 계수는 조정 가능한 여기 시스템의 스펙트럼 출력의 파장 의존적 변동을 보상합니다. 이는 광학 조명 전력이 낮은 전력 여기를 가진 파장에 필적하도록 높은 전력 여기로 파장을 스케일링하여 평평한 스펙트럼 여기 프로파일을 달성함으로써 달성됩니다. 부적절한 보정 계수의 예로는 하나 이상의 파장에서 매우 낮은 값(예: lt;0.001)을 포함하는 것이 있으며, 이는 평평한 스펙트럼 응답을 얻기 위해 해당 파장에서 측정된 강도 값을 크게 감쇠해야 함을 나타냅니다.
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토론
여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 셋업의 최적 사용은 광경로의 구성에서 시작됩니다. 특히 광원, 필터(튜닝 및 이색), 필터 스위칭 방법 및 카메라의 선택은 사용 가능한 스펙트럼 범위, 가능한 스캔 속도, 검출기 감도 및 공간 샘플링을 결정합니다. 머큐리 아크 램프는 많은 여기 파장 피크를 제공하지만 평평한 스펙트럼 출력을 제공하지 않으며 NIST 추적 가능한 응답(38)으로 스펙트럼 이미지데이터를 다시 보정하기 위해 출력 피크에서 상당한 신호 감소를 요구합니다. Xe 아크 램프 및 백색광 초등부 레이저와 같은 대체 광원은, 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼이미징(38,39,40)에더 적합한 보다 균일한 스펙트럼 출력을 제공할 수 있다. 광원, 튜닝 가능한 필터 및 이색 필터의 선택은 사용 가능한 스펙트럼 범위를 결정합니다. 이.......
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공개 사항
Drs. Leavesley와 Rich는 스펙트럼 이미징 기술을 상용화하기 위해 설립된 신생 기업인 SpectraCyte LLC에 대한 재정적 지분을 공개합니다.
감사의 글
저자는 NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL1370, AHA 18PRE34060, AHA 18PRE3406016의 지원을 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NDRI(Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange)NDRI | 에서 얻은 인간 폐 조직에서 분리 | 고자가형광, 칼슘에 민감한 세포 |
| Automated | Shutter Thorlabs Inc. | SHB1 | 광표백을 최소화하기 위한 원격 제어 가능한 셔터 |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | 자동화된 다중 시야 또는 스티칭 이미지 수집을 위한 원격 제어 가능한 스테이지. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | Automated Stage와 컴퓨터 및 조이스틱 버퍼 인터페이스용 |
| 제작 | 7.3 Cell Chamber에서 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM Hepes, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2 및 1mM CaCl2 | ||
| A7816 | : 수술용 스테인리스강과 고무 O-링으로 구성된 커버슬립 홀더, 매체를 밀봉하고 시료 및/또는 대물렌즈 오염을 방지합니다 | ||
| 필터 | Semrock, Inc. | TBP01-378/16 | 중심 파장 범위(340-378nm), 대역폭(최소 16nm, 공칭 FWHM 20nm), 굴절률(1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | 중심 파장 범위(360-400nm), 대역폭(최소 16nm, 공칭 FWHM 20nm), 굴절률(1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | 중심 파장 범위(400-448.8nm), 대역폭(최소 15nm, 공칭 FWHM 20nm), 굴절률(1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | 중심 파장 범위(448.8-501.5nm), 대역폭(최소 15nm, 공칭 FWHM 20nm), 굴절률(1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | 중심 파장 범위(501.5-561 nm), 대역폭(최소 14 nm, 공칭 FWHM 20 nm), 굴절률(1.83) | |
| 형광 필터 큐브 이색성 빔스플리터 | Semrock Inc. | FF495-Di03 | 495 nm에서 여기광과 방출광을 분리합니다(350-488 nm 간 >98% 반사율, 502-950 nm 간 >93% 투과율), 필터 유효 지수(1.78) |
| 형광 필터 큐브 롱패스 필터 | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | 496nm(503.2-1100nm 사이 >93% 평균 투과율)보다 긴 빛의 통과 허용, 굴절률(1.86) |
| GCaMP 프로브 | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2 based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating | Sphere Ocean Optics | FOIS-1 | 광각 조명의 정확한 측정에 사용되는 |
| 도립 형광 현미경 | Nikon Instruments | TE2000 | 도립 현미경은 매체 및/또는 조직 층을 관통할 필요 없이 시료를 직접 여기할 수 있습니다. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | 라벨 미토콘드리아 |
| NIST-추적가능 캘리브레이션 램프 | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | 사용하기 위한 알려진 스펙트럼이 있는 램프 |
| ThermoFisher Scientific | F36915 | 시스템의 적절한 스펙트럼 응답을 확인하기 위해 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | 라벨 세포핵 |
| 대물렌즈(10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | 넓은 시야에 유용 |
| Objective(20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | 조직 샘플에 가장 많이 사용됨 |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | 세포 샘플에 가장 많이 사용됨 |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | 고감도 디지털 이미지 획득용 |
| 분광계 | Ocean Optics | QE65000 | 여기 스캐닝 스펙트럼 시스템의 스펙트럼 출력을 측정하는 데 사용됨 |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | 자동 여기 필터 튜닝을 위한 전동 장치/ 스위칭 |
| 크세논 아크 램프 | Sunoptic Technologies | Titan 300HP 광원 | 비교적 균일한 스펙트럼 출력을 가진 광원 |
참고문헌
- Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
- Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements an....
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