Method Article

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

DOI:

10.3791/59449

⸱

May 22nd, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Neuroscience, University of Virginia School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 비-랜덤 X 염색체 불 활성화와 함께 실행 가능한 여성 뮤 린 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 하 고, 즉 임산부-상속 된 X 염색체는 세포의 100%에서 불활성 이다. 우리는 또한 생체 내에서 비활성 X 염색체의 약리학 적 재 활성화의 타당성, 내성 및 안전성을 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X 염색체 불 활성화 (XCI)는 남녀 간의 유전자 투약 균형을 달성 하기 위해 암컷에서 1 개의 X 염색체의 랜덤 침묵 이다. 결과적으로, 모든 암컷은 X-연결 유전자 발현에 대 한 이종 접합 이다. XCI의 주요 규제 기관 중 하나는 XCI의 시작과 유지 보수에 필수적인 Xist입니다. 이전 연구는 큰 규모의 기능 손실 유전 화면을 사용 하 여 13 개의 트랜스 행 X 염색체 불 활성화 인자 (XCIFs)를 확인 했습니다. ACVR1 및 PDPK1와 같은 XCIFs의 억제는 짧은 헤어핀 RNA 또는 소 분자 억제제를 사용 하 여 배양 된 세포에서 X 염색체 연결 유전자를 재 활성화 합니다. 그러나 생체 내에서 비활성 X 염색체를 재 활성화 시키는 타당성 및 내성이 결정 될 수 있다. 이 목표를 향하여, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형은 1 개의 X 염색체에 xist 의 삭제 때문에 비 랜덤 xci로 생성 되었습니다. 이 모델을 사용 하 여 비활성 X 재 활성화의 정도는 마우스 뇌에서 XCIF 억제제로 처리 된 다음에 양자화 되었다. 최근 발표 된 결과에 따르면, 처음으로 XCIFs의 약리학 적 저해는 살아있는 마우스 뇌의 대뇌 피 질의 뉴런에서의 비활성 X 염색체 로부터 Mecp2 을 재 활성화 시킨다.

Introduction

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X 염색체 불 활성화 (XCI)는 x 염색체의 1 카피를 여성에 게 침묵 시켜 서 X-연결 된 유전자 발현을 균형 조정하는 투약 보상의 과정 이다. 그 결과, 비활성 X 염색체 (Xi)는 히스톤 H3-리 신 27 trimethylation (H3K27me3) 및 히스톤 H2A 유비퀴틴 화와 같은 DNA 메 틸 화 및 억제 히스톤을 포함 하는 이종 염색 질의 특징을 축적 한다 (H2Aub) 2. x 염색체 침묵의 마스터 조절기는 x 염색체의 카운팅 및 쌍을 제어 하는 약 100500kb의 x-불 활성화 센터 (Xic) 영역, 비활성화를 위한 x 염색체의 무작위 선택 및 개시 및 X 염색체를 따라 침묵의 확산3. X 불 활성화의 과정은 x 염색체 전체의 침묵을 매개 하 고 3 차원 구조를 리 모델링 하 여 ci 에 Xi를 코팅 하는 비활성 특이 적 전사체 (xist) x에 의해개시 된다. 최근에, 몇몇 프로테오 믹 및 유전 성 스크리닝은 xci,예컨대 xist 상호작용 단백질

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Protocol

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마우스와 관련 된 작업 버지니아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (IACUC; #4112).

1. Mecp2 에 유전으로 표시 된 비 랜덤 Xci 마우스 모델 생성

참고: 연구에 사용 되는 마우스 균 주는 다음과 같이 하였다: Mecp2-gfp/Mecp2-gfp (Mecp2 tm는 새, 물자의 테이블) 및 xist/δ xist (B6 > <;를 제공 합니다. 안토니오 베다로 브, 프레드 허 친 슨 암 센터, 시애틀). 각각의 균 주 들 중에서 사육 전략은 각각의 균 주에 대 한 마우스 콜로 니를 확장 하도록 설계 되었다.

  1. 표 1에 열거 된 유전자 특이 적 프라이 머를 사용 하 여 사육 후 얻어진 모든 생쥐 균 주와 각각의 양성자에 대 한 PCR 유전형 분석을 수행 한다.

2. 생성 하는 마우스 사육 전략을 설계 합니다. Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp

  1. Mecp2-Gfp/Y 수 컷과 XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 여성을 함께 하우징 하 여 번 식 쌍을 설정 합니다 (....

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Results

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Xistδ의 타당성을 입증 하기 위해 : Mecp2/Xist: xi 재 활성화 연구를 위한 Mecp2 마우스 모델, xcif 억제제-xi-연결 된 Mecp2-gfp 의 매개 된 재 활성화는 마우스 배아 섬유 아 세포 (mefs)에서 시험 되었다. 여성 MEFs는 제 3 항 (도 1a)에 기재 된 바와 같은 15.5 Xistδ: Mecp2/xist 에서 분리 되었다. 여성 Xistδ의 유전형: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mefs는 앞서 설명한 바와 같이 유전형 분석 PCR에 의해 확인 되었다 (도 1b), 및 FACS 계 검정 법 (도 1c). MEFs는 7 일 동안 DMSO 또는 2 개의 약물 LDN193189 및 GSK650394 (각각 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이전에, 포유동물 여성 세포에서 Xi-연결 된 유전자의 침묵을 위해 선택적으로 요구 되는 XCIFs는12를 동정 하였다. 우리는 마우스 섬유 아 세포 주, 마우스 대뇌 피 질의 뉴런 및 인간 섬유 모 세포에서 Xi-연결 된 Mecp2 을 효율적으로 재 활성화 하는 PDPK1의 ACVR1 및 다운스트림 이펙터와 같은 xcifs를 대상으로 하는 강력한 소 분자 억제제를 추가로 최적화 했습니다. RTT 환자에서 파생 된 라인입니다. 이러한 결과는 Xi 재 활성화가 X-연결 된 질병 환자의 유전자 결핍을 구출 하는 그럴듯한 치료 적 접근법 임을 시사 한다. 그러나 생체 내 실현 가능성은 결정 되어야 한다. 최근에, XCIF 억제제는 Mecp2 의 Xi-연결 된 생체 내를 재 활성화 시키는 것으로 나타났다,이는 비 랜덤 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모델을 생성 하였다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 시 약을 제공 하기 위한 안토니오 Bedalov 감사 합니다; 냉동 절편에 대 한 버지니아 조직 조직학 코어 대학; 유 세포 분석을 위한 버지니아 대학교 유 세포 분석기 코어; 크리스천 블루와 샐로 니 싱은 유전형 분석에 대 한 기술 지원을 제공 합니다. 이 작품은 Z.Z.에 더블 후 연구 보조금에 의해 지원 되었다, 및 S.B.에 대학 버지니아 테크 종자 펀드 상 및 Hartwell 재단 개별 생물 의학 연구 상에서 파일럿 프로젝트 프로그램 상 수상

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MICE
Mecp2tm3.1BirdThe Jackson Laboratory#014610
B6; 129-Xist (tm5Sado)제공 안토니오 베달로프, 프레드 허친슨 암 센터, 시애틀
시약
22x22 mm 커버슬립FISHERfinest (Fisher Scientific)125488
32% 파라포름알데히드전자 현미경 과학15714-S
50ml 주사기Medline IndustriesNPMJD50LZ
60mm 배양 접시CellStar628160
7-AAD BioLegend420403
염화암모늄(NH4Cl)Fisher ChemicalA661-3
anti-GFP-AlexaFluor647InvitrogenA-31852
anti-MAP2Aves LabsMAP
BSAPromegaR396D
부프레노르핀 SRZoopharm
구연산 SigmaC-1857
DMSOFisher BioreagentsBP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning Cellgro10-013-CV
EthanolDecon Labs2701
소 태아 혈청 (FBS)VWR Life Science89510-198
젤라틴Sigma-AldrichG9391
유리 슬라이드Fisherbrand22-034-486
염소 안티-닭 FITC 표지 2차 항체 Aves LabsF-1005
GSK650394ApexBioB1051
hamilton 10μ l 주사기 Hamilton Sigma-Aldrich28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
KetamineKetasetNDC 0856-2013-01
Large blunt/blunt curved scissorsFine Science Tools14519-14
LDN193189Cayman Chemicals11802
lodixanolSigma
염화마그네슘(MgCl2)Fisher ChemicalM35-212
메틸셀룰로오스시그마M0262-100G
마운팅 미디어(DAPI VectashieldH-1200
니들 팁, 26 GA x 1.25"PrecisionGlide305111
안과 연고 Refresh Lacri-Lube93468
최적 절삭 온도(O.C.T.) ThermoFisher
PCR 혼합물
페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep)Corning30-002-Cl
인산염 완충 식염수 pH 7.4(PBS)Corning Cellgro46-103-CM
염화칼륨(KCl)Fisher ScientificP330-500
메스 블레이드
얕은 유리 또는 플라스틱 트레이
피부 접착제 / 조직 접착제3M Vetbond1469SB
아 지드 화 나트륨Fisher ScientificCAS 26628-22-8
염화나트륨 (NaCl)Fisher ChemicalS642-212
표준 지혈 겸자Fine Science Tools13013-14
표준 핀셋미세 과학 도구11027-12
스트레이트 아이리스 가위미세 과학 도구14058-11
자당Fisher ScientificBP220-1
트리스 기반피셔 생물 시약BP152-5
트리톤 X-100피셔 생물 시약BP151-500
트립신-EDTA Gibco15400-054
XylazineAkornNDC: 59399-111-50
장비
Zeiss AxioObserver 라이브 셀 현미경 ZeissZeiss AxioObserver
0.45mm 버IDEAL MicroDrill67-1000
BD FACScalibur
원심분리기
유리 균질화기
세포 배양 인큐베이터Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i13-998-213
Leica 3050S 연구용 저온 유지 장치 정
위 플랫폼
thermocycler
타이머
초원심분리기Beckman Coulter Optima L-100 XP
수조 (37 º C)피셔 사이언티픽 Isotemp 2239
1343517

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
  2. Heard, E.

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X Chromosome InactivationMecp2 ReactivationNon random Mouse ModelStereotactic InjectionXCIF InhibitorsBrain Tissue ProcessingImmunofluorescence StainingFlow Cytometry AnalysisGFP tagged Mecp2Pharmacological Reactivation

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