Method Article

참조되지 않은 태평양 굴에서 사실상 순차적 cDNA 라이브러리 생성을 위한 수렴 전략

DOI:

10.3791/59462

⸱

June 13th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, 2College of Life Science, Nanjing Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 참조되지 않은 태평양 굴 견본에서 RNA 견본을 사용하는 방법에 대한 전략을 기술하고, 사실상 연속된 cDNA 라이브러리를 생성하기 위하여 공개적으로 유효한 게놈 데이터와 비교하여 유전 물질을 평가합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

새로운 세포주 또는 게놈 시퀀싱 프로젝트의 개발과 같은 주요 실험에서 이전에 사용되었던 기준 종의 생물학적 물질에 대한 접근은 종종 추가 연구 또는 제3자에 대한 제공이 어렵습니다. 샘플의 소모적 특성. 현재 아시아, 오스트레일리아 및 북미의 태평양 연안에 널리 분포되어 있지만, 개별 태평양 굴 표본은 유전적으로 매우 다양하므로 유전자 라이브러리의 시작 물질로 직접 적합하지 않습니다. 이 기사에서는 지역 해산물 시장에서 얻은 참조되지 않은 태평양 굴 표본을 사용하여 cDNA 라이브러리를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이들 라이브러리는 공론화된 굴 게놈과 비교하였고, 가장 가까운 관련 라이브러리는 미토콘드리아 기준 유전자 시토크롬 C 옥시다아제 소단위 I(COX1) 및 NADH 탈수소효소(ND)를 사용하여 선택하였다. 생성된 cDNA 라이브러리의 적합성은 UDP-글루쿠로닉 산 탈수소효소(UGD) 및 UDP-자일로스의 생합성을 담당하는 UDP-자일로오스 신타제(UXS)를 코딩하는 두 유전자의 복제 및 발현에 의해 입증된다. UDP-포도당.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

긴 납품 시간, 기업가 추론 또는 국가별 관세 규정으로 인해 살아있는 참조 생물학적 물질의 취득이 어려울 수 있습니다. 대안으로서, 요구되는 생물학적 물질은 또한 전형적으로 동일한 시편으로부터 수집될 수 있다. 그러나, 이 견본은 유전자형의 수준에 현저하게 변화할 수 있고, 그러므로 동일 종의 디지털로 저장된 기준 게놈과의 비교는 수시로 새로 공급된 물자의 비호환성 때문에 어렵거나 심지어 쓸모없는 렌더링됩니다 기존 DNA 증폭 방법. 개별 시료의 고도로 보존된 유전자를 시퀀싱하는 것은 cDNA라이브러리 2의 품질 평가를 위한 기준 유전자로 자주 사용되는 보존된 미토콘드리아 유전자와 같은 종 1을 식별하기 위한 널리 사용되고 강력한 도구입니다2 ,3,4,5,6. 본명 제시된 방법에 대한 근본적인 근거는 기준 게놈의 상응하는 서열에 비해 개별 익명 굴 샘플에서 미토콘드리아 유전자 서열의 높은 보존이 다른 유전자도 나타낼 수 있음을 나타낸다는 것이다. 낮은 수준의 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 도식 개요는 그림 1에나와 있습니다.

1. 샘플 수집

  1. 굴 표본을 구하십시오. 수확 후 철기, 수송 및 실험실 사용 전에 얼음에 굴을 보관하고 구입 후 4-7 일 이내에 처리하십시오.
    참고: 이 프로토콜의 경우, 굴은 난징의 중카이 도매 시장(닝데, 푸젠, 중국, 랴오닝강, 장쑤성), 칭다오의 하이지 수산물 회사(중국 산둥성 칭다오에서 유래), 주청에서 구입했습니다. 연대(중국 산둥, 연타이)의 수산물 회사및 칭다오의 진시우 수산물 회사(중국 산둥 성 칭다오에서 유래).

2. 구니디늄 티오차네이트 페놀 추출에 의한 RNA 분리

  1. 굴 조직 샘플의 준비
    1. 멸균 된 메스로 각 굴 표본의 대략적인 기하학적 중심에서 약 100 mg의 균일 한 연조직을 잘라 내고 샘플을 액체 질소로 옮김을 옮김.
    2. 굴의 나머지 부분을 1시간 동안 -80°C에서 동결하여 안락사시키고 생물학적 폐기물로 버린다.
    3. 50 mL의 액체 질소로 채워진 박격포 (200 mL)에 미세 분말로 플래시 냉동 굴 조직을 갈아.
    4. 각 시편의 냉동 조직 75 mg을 멸균....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도 1은 태평양 굴 개인으로부터 유래된 수렴 cDNA 라이브러리의 기재된 제조 방법의 개략적 개요를 나타낸다. 도 2는 기준 물질의 COX1 및 ND 유전자 서열로부터 높은 발산을 가진 먼 관련 굴 시편의 COX1 및 ND 유전자의 서열을 나타낸다. 도 3은 기준 물질의 COX1 및 ND 유전자 서열로부터 낮은 발산을 가진 밀접하게 관련된 굴 시편의 COX1 및 ND 유전자의 서열을 나타낸다. 도 4는 산업적으로 관련된 유전자MgUGD 및 MgUXS를 복제하기 위해 cDNA 라이브러리의 성공적인 적용을 나타낸다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 프로토콜은 COX1과 ND 유전자를 공개적으로 이용 가능한 굴 DNA 게놈 데이터베이스와 비교하여 지역 해산물 시장에서 유사한 표현형을 가진 참조되지 않은 굴 표본의 유전 적 식별을 허용합니다. 이 방법의 중요성은 가상 cDNA 라이브러리의 평가를 위해 단일 PCR 반응만 필요하기 때문에 단순성입니다. 보존된 2개의 미토콘드리아 COX1 및 ND 유전자는 각 굴에서 RNA 추출물의 역전사에 의해 생성된 cDNA 라이브러리로부터 증폭되었다. RNA 분리 방법(단계 2.1)은 액체 질소에서 굴 조직을 직접 분쇄함으로써 단순화되었다. 각 시편의 COX1 및 ND 유전자를 시퀀싱한 후, 서열 정렬은 일부 샘플이 기준 균주와 높은 유사성을 보이는 것으로 나타났다. 가장 가까운 상대는 COX1 및 ND 유전자 서열 둘 다의 완전한 동일성을 보였다.

이 절차의 가장 중요한 단계는 RNA 추출 단계입니다. RNA 분해를 최소화하기 위해서는 굴 조직 수확과 RNA 추출 사이의 시간을 줄이.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 중국 자연과학 재단(교부금 번호 31471703, A020130537 및 31671854, J.V. 및 L.L.에 31670435) 및 100 외국 인재 계획(JSB2014012)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals:
1% Triton X-100Solarbio9002-93-1*대체 유통 가능
2,5-Dihydroxybenzoic acidAlfa Aesar490-79-9*대체 유통 가능
AcetonitrileMerck75-05-8* 대체 유통 가능
Agarose 분자생물학Biowest Chemicals111860*대체 유통 업체 가능
AmpicilinSolarbio69-52-3*대체 유통 업체 가능
클로로포름Lingfeng, Shanghai67-66-3*대체 유통 업체 가능
DEPC waterThermo ScientificR0601
EthanolJinhuada, Guangzhou64-17-5*대체 유통 업체 가능
Guanidinium thiocyanate-phenol 시약Invitrogen15596018TRIzol 시약
ImidazoleEnergy Chemical288-32-4* 대체 유통 업체 가능
이소 프로필 알코올Nanjing 화학 시약67-63-0* 대체 유통 업체 가능
Isopropyl β - D-thiogalactopyranosideSolarbio367-93-1*대체 유통
KanamycinSolarbio25389-94-0* 대체 유통 가능
LB AgarThermo Fisher22700025* 대체 유통 업체 가능
LB BrothThermo Fisher10855021* 대체 유통
메탄올Jinhuada, Guangzhou67-56-1*대체 유통
가능 MgCl2 hexahydrateXilong Huagong7791-18-6*대체 유통 가능
NaClXilong Huagong7647-14-5*대체 유통
NAD+Duly Biotech53-84-9*대체 유통 업체
페닐-메틸설포닐 플루오라이드맥클린329-98-6*대체 유통 업체 가능
TrisSolarbio77-86-1* 대체 유통 업체 가능
UDP-포도Wuhu Nuowei Chemicals28053-08-9* 대체 유통 업체 가능
UDP-글루쿠론산SIGMA63700-19-6* 대체 유통 업체 가능
도구/기기:
MALDI-TOF 질량분석기BrukerAutoflex*대체 유통업체 가능
금속 블록 히터Long Yang Scientific InstrumentsThermoshaker HB20*대체 유통업체 PCR
thermocyclerHema9600*대안 유통업체 가능
효소와 장비:
10× 결찰 완충액Thermo ScientificB69*대체 분배기
가능 5회; PrimeSTAR 버퍼Takara9158A
알칼리성 포스파타제ThermoFisher FastAPEF0654*대체 유통업체 가능COX
포워드 프라이머GenscriptATGTCAACAAATCATTTAGACATTG
COX 리버스 프라이머GenscriptACTTGACCAAAAACATAAGACATG
Cutsmart 버퍼NEBB7204S*대안 유통 업체 가능한
dNTP 믹스Invitrogen18427088
MgUGD 포워드 프라이머GenscriptACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT
MgUGD 리버스 프라이머GenscriptACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG
MgUXS 포워드 프라이머GenscriptCCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC
MgUXS 리버스 프라이머GenscriptACTCGAGCACATTTTTGAATTTGATTGCAGACGT
ND 포워드 프라이머GenscriptATGAGATGGCAATTATTTTTAT
ND 리버스 프라이머GenscriptATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC
PCR 클린업 키트AxyGenAP-PCR-250*대체 분배기 가능한
pET-30a(+) 벡터Merck Millipore69909
가능 가능 업체 가능 가능당

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
  2. Wen, J., et al. Species identification of drie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pacific OystercDNA LibraryRNA ExtractionCOX1 GeneND GeneSanger SequencingMALDI TOFGene CloningProtein ExpressionEnzyme Activity

Related Articles