이 프로토콜은 0-4일 된 마우스의 피부로부터 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 신속한 방법을 간략하게 설명한다. 이러한 1차 배양은 피부 세포 생물학, 색소 침착, 상처 치유 및 흑색종을 포함한 다양한 생리학적 관련 과정을 연구하기 위해 시험관 내에서 유지 및 조작될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
섬유아세포 또는 멜라닌세포 기능의 결함은 열악한 장벽 기능, 결함있는 상처 치유, 색소 침착 결함 및 암을 포함한 피부 질환과 관련이 있습니다. 이러한 질병의 이해와 개량에 필수적인 것은 1 차적인 섬유아세포 및 멜라닌세포 배양에서의 실험이다. 그럼에도 불구하고, 멜라닌세포 격리를 위한 현재 프로토콜은 피부의 표피 및 진피 층이 트립시니화되고 수동으로 분리되도록 요구한다. 이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 기술적으로 어렵고 일관성없는 수율에 기여합니다. 더욱이, 동일한 조직 샘플로부터 순수한 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 방법은 용이하게 사용할 수 없다. 여기서, 우리는 출생 후 일 0-4에 마우스의 피부에서 멜라닌 세포와 섬유 아세포를 분리하기위한 개선 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에서 전체 피부는 조직 헬기를 사용하여 기계적으로 균질화된 다음 콜라게나아제와 트립신으로 간략하게 소화됩니다. 세포 집단은 G418 처리에 선행된 선택적인 도금을 통해 그 때 단리됩니다. 이 절차는 90 분 이내에 단일 마우스에서 일관된 멜라닌 세포 및 섬유 아세포 수율을 초래한다. 이 프로토콜은 또한 쉽게 확장 할 수 있으므로 연구원은 실습 시간의 상당한 증가없이 동물의 큰 집단을 처리 할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 확립된 배양이 멜라닌세포 또는 섬유아세포에 대해 매우 풍부하다는 것을 유동 세포 측정 평가를 통해 보여줍니다.
서론
포유류 피부는 이물질과 자외선 조사 (UVR)로부터 신체를 보호하는 다층 기관입니다. 피부는 또한 상처 치유, 온도 조절 및 비타민 D 생산 1,2,3과같은 항상성 과정에 중요한 역할을합니다. 포유류 피부는 멜라닌 세포, 섬유아세포 및 각질 세포의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 세포 유형은 표피를 구성하는 각질 세포, 진피및 멜라닌 세포에 거주하는 섬유아세포가 표피-진피 접합부 및 모낭에 국한되는 등피부의 상이한 층을 채웁니다 4. 여기에서, 우리는 뮤린 피부에서 1 차적인 melanocyte 및 섬유아세포 배양물의 동시 생성을 가능하게 하는 간단한 절차를 자세히 설명합니다.
멜라닌세포는 기저표피, 홍채, 달팽이관, 뇌 및 모낭을 포함한 인체 전역의 많은 위치에서 발견되는 안료 생성 세포5. 멜라닌세포의 주요 기능은 멜라닌 함유 소포를 5,6. 멜라노솜은 멜라닌의 두 가지....
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프로토콜
동물과 관련된 다른 연구를 시작하기 전에 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 얻으십시오. 이 프로토콜에서 수행 된 실험은 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC, 프로토콜 #2012A00000134)에 의해 승인되었습니다.
1. 프로토콜 준비
참고: 다음 시약 제제 지침은 단일 마우스로부터 9 cm2 멜라닌세포 및 섬유아세포의 배양생성에 적합하다. 더 큰 스케일 절연은 표 1의 시약 준비 가이드를 참조하십시오.
- 0.1 m 빙하 아세트산에 50 μg/mL 콜라겐을 함유한 콜라겐 용액 1.5 mL을 준비합니다.
- 라미나 유량 캐비닛에 8 μg/cm2 (1.44 mL) 콜라겐 용액으로 6 웰 세포 배양 접시 중 하나를 코팅하십시오. 웰이 콜라겐 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 접시를 37°C에서 3시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다. 사용하기 전에, 1.35 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS)로 콜라겐 코팅을 2회 잘 세척하였다(1 cm당PBS 150 μL).
- 조직 헬기 플랫폼에 잘게 자른 ....
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결과
수컷 및 암컷 C57Bl/6J 마우스는 0-4일 후에 안락사되었고, 트렁크 피부는 전술한 바와 같이 기계적 해리를 행하였다. 잘라낸 후, 피부는 구조 조직의 흔적이없는 점성 슬러리를 형성했다. 이 슬러리의 원심 분리는 원유관의 바닥에 큰 세포 펠릿의 형성과 상층의 상단에 떠있는 지방층의 형성을 초래했다. 이 지방층은 상층부로 폐기되었고, 나머지 세포 펠릿은 재중단되어 6웰 접시의 코팅되지 않은 우물로 옮겨졌다. 셀의 밀도가 높음으로 인해 미디어가 흐린 것처럼 보입니다. 그러나, 배양 40분 후, 더 큰 세포 및 조직 재벌은 매체에서 관찰되었고 부착섬유아세포는 거꾸로된 광현미경으로 볼 수 있었다(도 1).
섬유아세포 배양으로부터 의 부착되지 않은 세포를 멜라닌세포를 분리시키기 위해 콜라겐 코팅된 6웰 접시 중 하나의 웰로 옮겼다. G418의 추가는 균질체에 있는 어떤 남아 있는 섬유아세포든지 죽였고, 다음 5일 동안 수많은 죽은.......
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토론
1 차적인 melanocytes및 섬유아세포의 체외 문화는 피부 생물학 및 질병의 우리의 이해에 있는 중요한 전진으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜은 피부 섬유아세포의 동시 분리를 허용하면서 일관된 멜라닌세포 배양을 생성하는 데 필요한 시간과 기술적 숙련도를 감소시킴으로써 이전의 멜라닌세포 분리 방법을 향상시킵니다. 이 절차의 새로운 시간 절약 요소는 진피와 표피를 분리 할 필요가 없다는 것입니다. 대신, 피부 세포는 선택적 매체 및 도금 기술과 더불어 기계 조직 헬기의 일관된 도마력 및 세분성을 사용하여 단리됩니다. 이 절차를 통해 처리 복잡성과 실습 시간을 단축함으로써 연구원들이 대규모 실험을 효율적으로 수행할 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 수율과 일관성을 향상시키기 위해 몇 가지 단계를 권장합니다. 첫째, 2.4 단계 이전에 는 곡선 집게를 사용하여 피부의 진피 측에서 지방 조직을 긁어 내는 것이 좋습니다. 이 과정은 원심 분리 후 형성 된 지방 케이크를 줄일 수 있.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 데이먼 러니온 재단 (혁신 상 #38-16 에 C.E.B.) 및 펠로토니아 (B.M.M.) 재정 지원을 감사드립니다. 원고 텍스트를 개선하기 위해 의견을 제공한 C. 헤인즈와 C. 웜스배처에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH P30 CA016058에 의해 지원되는 오하이오 주 포괄적인 암 센터의 분석 세포 분석 공유 자원에서 유익했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 & 마이크로; m PES 멸균 주사기 필터 | VWR | 28145-501 | |
| 10cm 세포 배양 접시 | Corning | 430167 | |
| 40 µ m 세포 스트레이너 | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브 | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6웰 세포 배양 접시 | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µ m 세포 여과기 | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 항생제 항진균 용액(100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| 소 혈청 알부민 | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain 항체 라벨링 키트 | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain 항체 라벨링 키트 | Biotium | 92274 | |
| 콜레라 독소 | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| 쥐 꼬리의 콜라겐 | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| 콜라겐 분해 효소 유형 I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning 페니실린/스트렙토마이신 솔루션 | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| 사이토케라틴 14 항체 Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| 에탄올, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| 소 태아 혈청 | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 항체 | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| 빙하 아세트산 | VWR | VWRV0714 | |
| 말 혈청 | 피셔 사이언티픽 | 26050088 | |
| HyClone L-글루타민 | 피셔 사이언티픽 SH3003402 | ||
| McIlwain 조직 헬기 | Ted Pella | 10180 | |
| 흑색종 gp100 항체 | Abcam | ab137078 | |
| 영양 믹스 F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| 피어스 16% 포름알데히드 | Thermo Fisher | 28908 | |
| 돼지 트립신 | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 매체 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 사포닌 | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| 조직 초퍼 블레이드 | Ted Pella | 121-6 | |
| 티슈 헬기 플라스틱 디스크 | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
참고문헌
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210
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