방법 논문

총 탄 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 세균 바이오 센서의 제조 및 적용

DOI:

10.3791/59471

⸱

2019년 5월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

이 논문에서

요약

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프로토콜은 총 총 잔류물의 분석을 위한 세균 바이오 센서의 세트를 합성 하 고, 형광 분 광 법을 사용 하 여 그들의 의도 된 사용을 위한 장치의 기능을 테스트 하기 위해 합성 생물학 기술을 사용 하 여 제시 된다.

초록

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MicRoboCop은 법의학 화학에서 독특한 응용을 위해 설계 된 바이오 센서입니다. MicRoboCop는 3 개의 주요 분석 물 (안티 몬, 납 및 유기 성분 GSR의)의 존재 하에서 형광 신호를 제조 함으로써 함께 사용 될 때, 총 탄 잔류물 (GSR)의 존재를 나타낼 수 있는 세 개의 장치로 구성 된 시스템 이다. 이 프로토콜은 대장균 (대장균)을 사용 하 는 바이오 센서의 합성 및 센서의 선택성 및 민감도를 평가 하는 데 사용 되는 분석 화학 방법을 설명 합니다. 시스템의 기능은 사용 된 카트리지 케이스의 내부에서 수집한 GSR을 통해 입증 됩니다. 일단 준비 되 면, 바이오 센서는 필요할 때까지 보관할 수 있으며 이러한 주요 분석 물에 대 한 테스트로 사용할 수 있습니다. 3 개의 분석 물 모두에서 긍정적 인 반응은 GSR에 대 한 추정 양성 검사를 제공 하는 반면, 각 개별 장치에는 다른 샘플의 분석 물을 검출 하는 응용 프로그램이 있습니다 (예: 식 수의 납 오염 검출기). 시스템의 주요 제한은 양성 신호에 필요한 시간입니다. 미래 작업은 응답 시간을 최적화 하기 위해 다른 유기 체를 연구 하는 것을 수반할 수 있습니다.

서론

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바이오 센서는 화학 물질 또는 분석 물의 검출에 사용 될 수 있는 반응을 생성 하는 생물학적 성분 (예컨대 단백질, 핵 산 또는 전체 유기 체)을 사용 하는 임의의 분석 장치 이다. 예를 들어 석탄 광산 산업은 20 세기의 대부분을 위해 석탄 광산1의 카나리아 인 독성 광산 가스의 존재를 감지 하는 바이오 센서를 사용 했습니다. 작업자를 보호 하기 위해 화학 물질 분석 물 (일산화 탄소)에 대 한 생물학적 유기 체의 반응 (카나리아의 사망 또는 고통)이 광부에 의해 관찰 되었습니다. 보다 현대적이 고 정교한 예에서, 박테리아는 형광 단백질의 발현과 같은 특이 적 반응을 나타내는 것에 의해 특정 화학적 분석 물질의 존재에 반응 하는 합성 생물학 기술을 사용 하 여 변경 될 수 있다.

합성 생물학은 자연적으로 존재 하지 않는 생물학적 장치 및 시스템의 건설을 지칭 하는 광범위 한 용어이 고, 또는 특정 목적을 위한 기존의 생물학적 시스템의 재설계2이다. 합성 생물학은 장치 및 시스템을 합성 하는 데 사용할 수 있는 표준 방법론 및 표준화 된 부품 (표준 합성 생물학 유전 요소)의 존재에 의해 유....

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프로토콜

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참고: RFP를 발현 하는 대장균 의 합성이 제시 된다.

1. 대장균 에서 플라스 미드 DNA의 제조

  1. Rfp 유전자와 암 피 실린 저항성 유전자를 갖는 플라스 미드를 포함 하는 대장균을 해 동 하 고, µ를 함유 100 하는 luria 브로스 (LB) 한 천 판에 대장균을 37 ° c에서 24 시간 동안 성장 시켰다. 예를 들어, 합성 생물학에 사용 되는 표준 생물학적 부품의 레지스트리에서 J10060 플라스 미드를 사용 하십시오 ( 재료 표참조). 상기 J10060 플라스 미드는 pBad 프로모터 영역과 암 피 실린 저항성 유전자의 제어 하에 RFP (적색 형광 단백질)에 대 한 유전자를 포함 한다. 대안적으로, 대장균 형질 전환 (3.2 단계 참조) 플라스 미드를 LB 한 천 판에 성장 시키기 전에.
  2. 표준 미니 준비 프로토콜 ( 재료 표참조)을 따라 J10060 플라스 미드를 포함 하는 대장균 배양 액 1 mL에서 DNA를 분리 합니다. 다음 프로토콜의 목적은 pBad 프로모터를 제거 하 고이를 장치에 대 한 원하는 프로모터로 대체 하는 것 이다.
  3. 플라스 미드....

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결과

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이 작품에 사용 된 RFP 변이체에 대 한 형광 스펙트럼은 도 2에 나타내 었 다. 이 데이터는 PbRFP 장치에서 리드 및 TNT-RFP 장치에 응답 하므로 두 개의 분석 물, 2, 4 DNT 및 1, 3 DNB에 응답 합니다. 이 수치는 음성 대조 군 (분석 물이 첨가 되지 않음)의 스펙트럼과 추가 된 두 가지 상이한 분석 물 레벨에서 스펙트럼을 보여줍니다. 사용 된 RFP 변이체에 대 한 최대 형광 신호는 575 nm에서 관찰 되었다 (여기 파장 500 nm). 도 3 의 데이터는 PbRFP 장치의 단일 적정 실험 (따라서 오차 막대가 포함 되지 않음)을 대표 하며, 프로토콜의 7 단계에서와 같이 적정 한다. 도 3a 는 휴대용 분 광 계 로부터 수집 된 데이터를 나타내고, 한편 도 3b 는 (동일한 세트의 용액 으로부터) fluorimeter .......

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토론

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수정 및 문제 해결

표 4 에 기재 된 실험은 설계 된 센서에 적합 한 임의의 방식으로 변형 될 수 있다. 화학 센서의 가장 중요 한 측면은 민감도와 특이성을 평가 하는 것입니다. 센서의 유용한 분석 범위를 결정 하기 위해 분석 물의 광범위 한 농도가 분석 되도록 하는 것이 유리 합니다. 또한 세포에 대 한 분석 물의 최대 수준을 결정할 가치가 있습니다. 본 연구에서 사용 된 분석 물 들이 메탄올 용액 (TNT 유도체)에서의 독성 금속 (Pb 및 Sb) 또는 유기 화합물 이기 때문에, 분석 물질 또는 용액의 독성으로 인 한 세포 사 멸이 발생 하는 상위 레벨이 존재 한다 (일반적으로 500-1, 0 보다 높은 지금까지 실시 한 실험을 위한 00 ppb).

기술의 한계

이 작품에서 제시 된 결.......

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공개 사항

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저자는 공개에 대 한 경쟁 금융 이익 또는 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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저자는 BIOL 324 (유전학)의 롱 우드 대학에서 학생 들과 화학 403 안티 몬 및 리드 바이오 센서의 초기 준비 및 테스트에 관여 한 (고급 화학 실험실 문제 해결) 학생 들을 인정 하고자 합니다. MicRoboCop에 대 한 아이디어는 GCAT SynBIO 워크샵 (여름 2014)에서 잉태 되었으며,이는 NSF와 하 워드 휴즈 메디컬 인스티튜트가 자금을 지원 하며 메릴랜드 대학교에서 주최 합니다. 저자는 또한 롱 우드 대학의 요리사-콜 예술과 과학의 대학과 GCAT SynBio 동창 보조금에서 받은 자금을 인정 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,3-디니트로벤젠, 97%AldrichD194255-25G
2,4-디니트로톨루엔, 97%Aldrich101397-5G
AgarFisher ScientificBP1423-500
암피실린Fisher ScientificBP1760-5
안티몬, 참조 표준 용액(1000ppm ± 1%/인증)Fisher ScientificSA450-100표준 묽은 HNO3
컷 스마트 버퍼New England BioLabsB7204S
이중 버퍼통합 DNA 기술11-01-03-00
EcoRI-HF 제한 효소New England BioLabsR3101S
에탄올, HPLC 등급, 변성Acros 유기물AC611050040용매는 HPLC 등급일 필요가 없으며 ACS 또는 시약 등급이 작동합니다.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA 염기서열분석 키트Eurofins GenomicsSimpleSeq 키트
포워드 프라이머5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'
DNA 염기서열분석을 위한 전방 프라이머Integrated DNA Technologies5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
IBI Science 고속 플라스미드 미니 키트IBI ScientificIB47101
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426-500
리드, 참조 표준 용액 (1000ppm ± 1%/인증)Fisher ScientificSL21-100표준 희석 HNO3
LeadOff 일회용 세척 및 데콘 물티슈Hygenall45NRCN용기 또는 개별 포장으로 판매되며 모든 알코올 기반 물티슈가 작동합니다.
메탄올, HPLC 등급Fisher ScientificA452-4용제는 HPLC 등급일 필요가 없으며 ACS 또는 시약 등급이 작동합니다.
NEB 5-알파 유능한 E. coli 세포New England BioLabsC2987I
NheI-HF 제한 효소New England BioLabsR3131S
뉴클레아제 무료 물New England BioLabsB1500S
OneTaq 표준 완충액이 있는 2X 마스터 믹스New England BioLabsM0482S
합성 생물학에 사용되는 표준 생물학적 부품 등록부의 플라스미드표준 생물학적 부품http://parts.igem.org/Main_Page
프로모터 서열통합 DNA 기술Sb 프로모터: 5'-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5'
Pb 프로모터 : 5'-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5'
TNT 프로모터: 5' GCATTCTAGAT
CAATTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3'
3' CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5'
통합 DNA 기술5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'에 대한 역 프라이머
DNA 염기서열분석을 위한 리버스 프라이머Integrated DNA Technologies5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
T4 DNA 리가아제뉴잉글랜드 BioLabsM0202S
콜로니 PCR 통합 DNA 기술용 표준 콜로니 PCR

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
  2. The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
  3. Roda, A., et al.

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태그

Escherichia coli

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