조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

Summary

세포 및 조직 coculture 이미징 질량 분석을 사용 하 여 작은 분자 exchange 검색에 맞게 샘플 준비 하는 새로운 방법 개발 되었다.

Abstract

질량 분석 (IMS) 이미징 정기적으로에 적용 된 세 가지 유형의 샘플: 조직 섹션, spheroids, 그리고 미생물 식민지. 이러한 샘플 유형은 관심사의 생물학 견본에서 단백질, 지질, 및 대사 산물의 분포를 시각화 하는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)를 사용 하 여 분석 되었습니다. 우리는 포유류 세포 배양에서 agarose로 시드 여 암, 화학 통신 식별 underexplored 접근을 해결 하기 위해 3 개의 이전 응용 프로그램의 장점을 결합 하 여 새로운 샘플 준비 방법 개발 건강 한 조직 샘플의 건조 뒤 coculture. 포유류 조직 및 세포는 조직과 세포 사이 보급을 통해 화학 통신을 허용 하는 가까운 근접에서 cocultured. 특정 시간 점에서 agarose 기반 샘플 미생물 식민지 IMS 분석에 대 한 준비와 같은 방식으로 건조 됩니다. 우리의 방법은 고급 액 난소 암 전이 동안 난소와 상호 작용 하는 나 팔 관에서 파생 된 간의 통신 모델을 개발 되었다. 샘플 준비의 최적화 결과 난소 microenvironment에서 주요 화학 성분으로 norepinephrine의 식별. 새로 개발된 된이 메서드는 인접 한 셀 또는 조직 간의 화학 커뮤니케이션의 이해를 필요로 하는 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다.

Introduction

3 널리 사용 되는 응용 프로그램에 기능을 분자의 공간 분포 특성에 최적화 된 질량 분석 (IMS) 이미징: 조직 슬라이스, spheroids, 및 미생물 식민지^1,2,3. 조직 조각 호스트, 타겟 또는 특정 대량 범위 내에서 타겟이 불분명 한 생물학 상황의 맥락에서 대사 산물의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 건강 한 조직 질병 상태, 예를 들어 종양에 비교 될 때 가장 중요 하 고 명백한 분자 기능 사이의 차이점은. 그러나 IMS 이렇게 질병 바이오 마커의 검출에 특히 적응은,, 질병의 진행 (예: 종양 등급)에 개별 단계에서 조직 샘플을 확보 하는 걸로의 개시에 대 한 중요 한 될 수 있는 신호 식별은 질병입니다. 공간을 통해 정보 교환 많은 생물 학적 시스템의 유비 쿼터 스 기능 이며 조직 조각이 동적 화학 릴레이 캡처할 수 없습니다. 화학 및 확산을 시각화 수 있는 1 개의 기술은 이다 한 천 배지;에 성장 하는 미생물 식민지의 IMS 작은 분자는 agar 전역을 통해 확산을 수 있으며 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI-TOF) 질량 분석⁴

Protocol

모든 동물 절차 지침에 따라 국립 연구소의 건강 관리 및 실험 동물의 사용 되었고, 시카고에 일리노이의 대학에서 기관 동물 사용 관리 (IACUC) 위원회에 의해 승인.

1입니다. 시 약의 준비

1. Murine oviductal 상피 (모에) 세포가 5% CO₂ 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 알파 최소 필수 매체 (αMEM) 미디어에서 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 m L-글루타민, 10 mg/mL 인슐린, 올려진다, m (FBS), 셀레늄 (ITS) 유지 1.8 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF), 100 U/mL 페니실린-스, 1 mg/mL gentamycin 및 18.2 ng/mL estradiol-17β. 3-4 일 마다 셀을 통과, 같은 날에 충분 한 셀이 보장 쥐 것 이다 희생.
2. 증류수 50ml와 낮은 녹는 agarose의 1 g을 혼합 하 여 2 %agarose 준비 합니다. 압력솥 agarose, 냉각, 그리고 2 mL에 다음 약 수 (1 mL) 튜브 ( 재료의 표참조) agarose 고형화 하기 전에. Agarose는-20 ° C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.
3. 1 x Dulbecco의 수정이 글의 중간 (D....

Results

최적으로 말린된 이토 슬라이드와 평면 desiccated 샘플 귀 착될 것 이다 agarose와 agarose 조각을 슬라이드 (그림 3)에서 공간 별거를 유지 하는 표면에서 주름을 최소화. 그림 3A 보여줍니다 최적의 건조, 그림 3B 보여 주름을 피해 야 한다. 이 최적화에 주의 상대 습도에 따라 정확한 시간 수 다를 오븐에서 슬라이드의 모니터링이 필요 합니다. 주름을 약간 높이 영향을 미칠 수 따라서 IMS의 대량 정확도 신호 하는 동안 약간의 주름 데이터의 품질을 영향 하지 않습니다. 따라서, 궁극적으로 약간의 주름을가지고 어떤 agarose 여전히 MALDI TOF MS를 통해 분석할 수 있습니다. 슬라이드를 완전히 건조 해야 합니다 또는이 MALDI TOF 질량 분석기의 높은 진공 환경에서 샘플의 폭발.......

Discussion

HGSOC^12,,1718, norepinephrine의 역할 연루 증거의 성장 시체 이며이 기술은 더 기계 정보를 기여 하고있다. 생물 학적 조건 같은 슬라이드에 적어도 8, 메서드 단일 IMS에 미디어 컨트롤 뿐만 아니라 유전자와 세포 특이성 run과 같은 생물 학적 컨트롤에 대 한 계정 수 있습니다. 메서드가 최적화 되었습니다 동안 평가 하 교환 HGSOC, 모든 셀에에서 기본 전이 모델에서 작은 분자 또는 조직 유형 agarose에 배치할 수 있는 다양 한 생물 학적 질문 및 질병 상태를 분석 하 대용 될 수 있다.

프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 조직 또는 세포 유형 서로 게 가까운 근접에서 고 agarose 플러그의 중심에 존재 하도록은. 또 다른 중요 한 고려 사항은 전체 슬라이드에 대 한 건조.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Falcon tubes	Denville	C1017-O	세포를 수집하기 위해
8-웰 챔버 (Millipore EZ-slide 챔버)	Millipore	PEZGS0816	Millipore Millicell EZ-slide 챔버 슬라이드에서 용도 변경
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	스프레이 매트릭스용 용매
알파 최소 필수 매체 (α MEM)	Fisher	10-022-CV	세포 배양 배지
Autoflex speed MALDI-TOF LRF	Bruker		IMS 데이터 분석용
원심분리기	Eppendorf	5810 R	세포 수집 및 상등액 제거
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix 건조 슬라이드에 분사
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix 분사 건조 슬라이드에
일회용 메스	Fisher	22-079-707	난소 제거용
Dispirting	Scissors Fisher	13-804-6	난소 제거용
DMEM Media	Gibco	11995-065	아가로스
표피 성장 인자	Peprotech Inc.	100-15	세포 배양 배지 보충제
Eppendorf 튜브	Genesee Scientific	22-282	아가로스 부분 표본
Estradiol-17β	Simga-Aldrich	E2758	세포 배양 배지 보충제
Fetal Bovine Serum	Denville	fb5001	세포 배양 배지 보충제
FlexControl 3.4	Bruker Daltonic		IMS 데이터 수집 소프트웨어
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		IMS 데이터 분석 소프트웨어
겸자 (fine)	Fsiher	22-327379	제거용 난소
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	세포 배양 배지 보충제
인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	세포 배양 배지 보충제
ITO 코팅 슬라이드	Bruker	8237001	공동 배양 배양을 위한 플랫폼
Leibovitz의 L-15 Medium	Gibco 11415064		조직 중에 사용되는 배지 dissection
L-glutamine	Gibco	25030-081	세포 배양 배지 보충제
저융점 아가로스	Sigma-Aldrich	A9414-10G	도금용 매체와 혼합
배지 분지	Corning	4870	분할 챔버용 플라스틱 칸막이를 절단하는 데 사용
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140-122	세포 배양 배지 보충제
펩타이드 보정 표준	Bruker Daltonic	8206195	중간 질량 범위에 대한 보정
포포러스 레드	Sigma-Aldrich	343-242-5G	낮은 질량 범위에 대한 보정
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS 데이터 통계 분석
외과 겸자 (무딘)	Fisher	08-875-8B	난소 제거
TFA	Fisher 매트릭스	솔루션에 추가된	A116-50
TM 분무기	HTX 기술		매트릭스 적용용