조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

요약

세포 및 조직 coculture 이미징 질량 분석을 사용 하 여 작은 분자 exchange 검색에 맞게 샘플 준비 하는 새로운 방법 개발 되었다.

초록

질량 분석 (IMS) 이미징 정기적으로에 적용 된 세 가지 유형의 샘플: 조직 섹션, spheroids, 그리고 미생물 식민지. 이러한 샘플 유형은 관심사의 생물학 견본에서 단백질, 지질, 및 대사 산물의 분포를 시각화 하는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MS MALDI TOF)를 사용 하 여 분석 되었습니다. 우리는 포유류 세포 배양에서 agarose로 시드 여 암, 화학 통신 식별 underexplored 접근을 해결 하기 위해 3 개의 이전 응용 프로그램의 장점을 결합 하 여 새로운 샘플 준비 방법 개발 건강 한 조직 샘플의 건조 뒤 coculture. 포유류 조직 및 세포는 조직과 세포 사이 보급을 통해 화학 통신을 허용 하는 가까운 근접에서 cocultured. 특정 시간 점에서 agarose 기반 샘플 미생물 식민지 IMS 분석에 대 한 준비와 같은 방식으로 건조 됩니다. 우리의 방법은 고급 액 난소 암 전이 동안 난소와 상호 작용 하는 나 팔 관에서 파생 된 간의 통신 모델을 개발 되었다. 샘플 준비의 최적화 결과 난소 microenvironment에서 주요 화학 성분으로 norepinephrine의 식별. 새로 개발된 된이 메서드는 인접 한 셀 또는 조직 간의 화학 커뮤니케이션의 이해를 필요로 하는 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다.

서론

3 널리 사용 되는 응용 프로그램에 기능을 분자의 공간 분포 특성에 최적화 된 질량 분석 (IMS) 이미징: 조직 슬라이스, spheroids, 및 미생물 식민지^1,2,3. 조직 조각 호스트, 타겟 또는 특정 대량 범위 내에서 타겟이 불분명 한 생물학 상황의 맥락에서 대사 산물의 지역화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 건강 한 조직 질병 상태, 예를 들어 종양에 비교 될 때 가장 중요 하 고 명백한 분자 기능 사이의 차이점은. 그러나 IMS 이렇게 질병 바이오 마커의 검출에 특히 적응은,, 질병의 진행 (예: 종양 등급)에 개별 단계에서 조직 샘플을 확보 하는 걸로의 개시에 대 한 중요 한 될 수 있는 신호 식별은 질병입니다. 공간을 통해 정보 교환 많은 생물 학적 시스템의 유비 쿼터 스 기능 이며 조직 조각이 동적 화학 릴레이 캡처할 수 없습니다. 화학 및 확산을 시각화 수 있는 1 개의 기술은 이다 한 천 배지;에 성장 하는 미생물 식민지의 IMS 작은 분자는 agar 전역을 통해 확산을 수 있으며 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI-TOF) 질량 분석⁴를 통해 캡처할 수 있습니다. 이 성장 설치 개별 생물 엔터티 (식민지) 간에 교환 하는 분자를 식별 하는 데 수 고 또한 대사 산물 생산의 방향성을 결정할 수 있습니다. 원래 미생물 식민지 성장을 위해 설계 된 플랫폼 적응 포유류 세포, 성장 조직 explants의 기본 신진 대사를 탐험 하 고 IMS는 생체 외에서 포유류 시스템에서 동적 화학 교환 평가 하는 데 사용 되었다.

지난 몇 년 동안, 그것은 분명 고급 액 난소 암 (HGSOC) 종종 나 팔 관 상피 (FTE)에서 유래 하 고 다음 초기 질병 개발^5,6, 중 난소에 metastasizes 되고있다 ^{7 , 8}. tumorigenic FTE 확산 어디 결국 큰 종양 형성 및 전이 더, 난소 세포 이유 현재 명확 하지 않다. 이전 연구는 난소; 하 주 전이 난소 단백질의 역할에 집중 그러나, 그것은 최근 증명 되었습니다 tumorigenic 조직에 건강에서 전환 세포질 물질 대사의 대규모 장애 발생 및 작은 분자^9,,1011의 생산을 변경. 따라서, 우리가 가설 작은 분자는 FTE 및 난소 사이 교환 분할 책임 있는 HGSOC의 주 전이 될 수 있습니다.

우리의 새로 개발된 된 IMS 절차를 사용 하 여, 우리 결정 coculture tumorigenic FTE 및 건강 한 난소 조직을 난소에서 norepinephrine의 생산을 유도 한다. 그러나, 다른 세포 유형 또는 정상적인 FTE 셀이이 효과 유도 하지 않았다. 이 방법의 특별 한 혜택은 분자 생산 및 실제 분자를 나타내는 신호를 교환 구상 될 수 있다, 그래서 심지어는 coculture에서는 신호의 소스를 확인할 수 있습니다. 이것이 무 균된 샘플의 분석에 이점을 모든 공간 정보가 손실 됩니다. 우리의 모델 시스템에서 명확 하 게 난소에 norepinephrine의 생산을 할당할 수 있었습니다. Norepinephrine 전이 및 chemoresistance 난소 암에 연결 되었습니다 및이 분자의 우리의 감지 소설 IMS 메서드 생물학 관련 분자^12,13, 를 찾아낼 수 있습니다 확인 했다 ¹⁴.이 유효성 검사 제안 하는 IMS의이 새로운 응용 프로그램 그룹을 coculture 환경에서 작은 분자를 식별 하 고 셀 변환에 영향을 주는 초기 이벤트를 이해 하는 것을 시도 하는 연구를 특히 도움이 될 수 있습니다 그리고 전이입니다. 이 방법의 전반적인 목표는 정체성과 조직 및 장기, 3D 세포 배양 체 외에서 또는 vivo 전 조직에 의해 표현 사이의 교환 동안 작은 분자의 공간적 분포를 명료 하 게.

프로토콜

모든 동물 절차 지침에 따라 국립 연구소의 건강 관리 및 실험 동물의 사용 되었고, 시카고에 일리노이의 대학에서 기관 동물 사용 관리 (IACUC) 위원회에 의해 승인.

1입니다. 시 약의 준비

1. Murine oviductal 상피 (모에) 세포가 5% CO₂ 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 알파 최소 필수 매체 (αMEM) 미디어에서 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 m L-글루타민, 10 mg/mL 인슐린, 올려진다, m (FBS), 셀레늄 (ITS) 유지 1.8 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF), 100 U/mL 페니실린-스, 1 mg/mL gentamycin 및 18.2 ng/mL estradiol-17β. 3-4 일 마다 셀을 통과, 같은 날에 충분 한 셀이 보장 쥐 것 이다 희생.
2. 증류수 50ml와 낮은 녹는 agarose의 1 g을 혼합 하 여 2 %agarose 준비 합니다. 압력솥 agarose, 냉각, 그리고 2 mL에 다음 약 수 (1 mL) 튜브 ( 재료의 표참조) agarose 고형화 하기 전에. Agarose는-20 ° C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.
3. 1 x Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 미디어의 적어도 2 개 mL를 준비 합니다.
4. MALDI TOF MS에 대 한 행렬에 대 한 준비 10 mL 5 mg/mL의 1:1 알파-cyano-4-hyroxycinnamic 산 (CHCA): dihydroxybenzoic 산 (DHB) ( 재료의 표참조) 90: 10 ACN:H₂O + 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA). 매트릭스를 해산 때까지 솔루션을 sonicate.

2. 마우스 식민지 및 난소 제거

1. 표준 주택 절차를 사용 하 여 CD-1 쥐의 번 식 쌍을 유지 합니다. 출산 일 가까이 확인 쥐 매일 있도록 새끼 나이 알려져 있다.
2. NIH 지침 당 CO₂ 흡입에 의해 나이 16-18 일에 강아지를 안락사. CO₂ (100%)를 제공 흐름 율 10%-20%의 용량 분당 고 호흡 중지 했다 후에 2 분 동안 계속. 자 궁 경부 전위 여 안락사를 확인 합니다.
3. 70% 에탄올에 잠수 하 여 모든 수술 장비를 소독. 따뜻한 Leibovitz의 L-15 미디어 1 x 페니실린-37 ° c.에 스
4. 젖은 머리와 오염 최소화 하 고 지역 소독 70% 에탄올과 복 부 표면. 잡고 피부 복 벽을 덮고 큰 있도록 무딘 집게와 사용에 대 한 수술가 위를 사용 하 여 V 자형 잘라 피부와 복 벽을 통해 내부 장기를 노출.
5. 쪽 집게를 사용 하 여 내부 장기를 이동 합니다. 개별적으로 각 자 궁 경적 미세 집게로을 약간 들어올립니다.
6. 난소를, 신장 바로 아래 자 궁 경적의 끝에 있을 것입니다 찾습니다. 수술가 위를 사용 하 여 결합 조직의 무료 난소를 해 부. 다음, 반으로 난소 나 팔을 잘라.
7. 난소, 수 란 관, 그리고 약 하나 이동 미리 따뜻하게 Leibovitz L-15 미디어 각 자 궁 경적의 절반.
8. 해 현미경으로 신중 하 게는 수 란 관, 부르사, 및 어떤 지방 조직에서 자유롭게 주변 부르사에서 각 난소를 이동 합니다. Leibovitz의 L-15 미디어의 새로운 요리를 각 난소를 이동 합니다.
9. 축방향 반으로 잘라 각 난소. 난소 조각 (지금 이라고 explants) agarose의 도금까지 37 ° C에서 보관 하십시오.

3. 설정 하 고 Cocultures에 대 한 이토 처리 슬라이드 잠복기

1. 전적인된 cocultures
   1. 뜨거운 접시에 70 ° C에서 agarose 유동화
   2. 인듐 tinoxide (이토) 위에 8 잘 분배기를 배치-대우 슬라이드 (그림 1A). 구분선에 고무 바닥 슬라이드, 접착 보조 하지만 새 또는 우물 사이 혼합 되도록 agarose 도금 동안 지속적인 부드러운 하향 압력을 적용 해야 합니다.
   3. 15 mL 원뿔 튜브, 분리기 (800 rpm에서 5 분), 세포를 수집 하 고 50 k resuspend 1 x DMEM 미디어에서 150 µ L 당 세포. 다른 셀 밀도 최적의 경우이 단계에서 세포 현 탁 액은 2 배 최종 밀도 원하는 (예를 들어,에 대 한 300 µ L,이 단계에서 세포 밀도에서 50, 000 셀의 최종 농도 50, 000 셀 150 µ L에) 있는지 확인 합니다.
   4. 세포 배양을 도금 하기 전에 난소 explant 추가 (그림 1B)의 센터에.
   5. 개별 2 mL 튜브 도금 직전에 각 세포 배양을 agarose를 추가 합니다. 각 잘 세포 현 탁 액의 200 µ L 및 2 mL 튜브에서 가스용 용기 agarose의 200 µ L를 결합 하 여. 예를 들어 4 개의 우물, 세포 현 탁 액의 800 µ L 및 2 %agarose 800 µ L를 결합 한다. 어떤 혼합, 남아 있을 것입니다 하지만 pipetting 동안 기포를 방지 필요 약간 이상 만들기.
      1. 바로 그 세포 배양을 도금 하기 전에 개별 셀 문화 agarose를 추가 합니다. agarose는 분 아래에서 시원한, 그래서 접시 빨리 준비 될 것 이다.
   6. 즉시 각 음 (그림 1C)에 셀/agarose 혼합물의 300 µ L를 추가 합니다. 그림 1 c 3 셀 조건 및 하나의 미디어 상태, 각 도금와 난소 없이 보여줍니다.
   7. 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 슬라이드를 품 어.
2. 분할된 Cocultures입니다.
   1. 디바이 더 얇은, 부드러운 플라스틱 (그림 2A)에서 잘라.
      참고:이 실험 때문에 평평 하 고 얇은 멸 균 일회용 미디어 분 지의 측면을 사용 합니다. 우물 (~ 13 m m)의 사변에 snugly에 맞게 충분히 넓게 단지 그들을 잘라.
   2. 뜨거운 접시에 70 ° C에서 agarose 유동화
   3. (그림 2B) 이토 처리 슬라이드 위에 8 잘 분배기를 놓습니다. 구분선에 고무 바닥 슬라이드, 접착 보조 하지만 새 또는 우물 사이 혼합 되도록 agarose 도금 동안 지속적인 부드러운 하향 압력을 적용 해야 합니다.
   4. 15 mL 원뿔 튜브, 분리기 (800 rpm에서 5 분), 세포를 수집 하 고 50 k resuspend 1 x DMEM 미디어에서 150 µ L 당 세포. 다른 셀 밀도 최적의 경우이 단계에서 세포 현 탁 액은 원하는 최종 밀도 x 2 있는지 확인 (예: 300 µ L에서 50, 000 셀의 최종 농도 대 한이 단계에서 세포 밀도 150 µ L에서 50000 셀).
   5. 우물 (그림 2C)에 대각선 플라스틱 분배기를 삽입 합니다.
   6. 도금 하기 전에 그냥 한 번에 한 각 세포 현 탁 액을 agarose를 추가 합니다. 각 잘 세포 현 탁 액의 100 µ L 및 2 mL 튜브에서 가스용 용기 agarose의 100 µ L를 결합 하 여. 예를 들어 4 개의 우물, 세포 배양의 400 µ L 및 2 %agarose 400 µ L를 결합 한다. 일부 셀/agarose 혼합물 남아 있을 것입니다 하지만 pipetting 동안 기포를 방지 필요 약간 이상 만들기.
      1. 바로 그 세포 배양을 도금 하기 전에 개별 셀 문화 agarose를 추가 합니다. agarose는 분 아래에서 시원한, 그래서 접시 빨리 준비 될 것 이다.
   7. 구분선의 1 개의 측에 셀/agarose 혼합물의 150 µ L 플레이트. Agarose 냉각 및 응고 (약 1 분) 분배기 (그림 2D) 제거를 허용 합니다.
   8. 난소 explant 우물의 빈 절반의 중앙에 배치 합니다. 난소, 그리고 우물 (그림 2E)의 올바른 측면에만 정상 장소 150 µ L media/agarose 혼합물.
   9. 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 슬라이드를 품 어.

4. 건조 슬라이드 MALDI TOF MS에 대 한 준비

1. 후 4 일 (또는 어떤 선호 시간 포인트) agarose 플러그 및 슬라이드 (그림 1D)에서 챔버 분배기를 제거. 부드럽게 편평한 주걱으로 약 실에서 agarose의 측면을 분리 하 고 부드럽게 당겨 챔버, 상향 되 고 어떤 agarose 플러그를 이동 하지 않도록 주의. 만약 그들이 이동 할 부드럽게 위치를 변경할 그들 그들은 서로 만지고 있다 그래야.
2. 장소 4 h 약 37 ° C 오븐에서 슬라이드 마다 h 90 ° 회전 합니다.
   참고: 슬라이드의 회전은 샘플에 걸쳐도 열 분포를 보장 하기 위해 중요 합니다.
3. 일단 건조, 오븐 (그림 1E)에서 슬라이드를 제거 합니다.
4. 다음 매개 변수 (그림 1 층), 분무기를 사용 하 여 행렬 솔루션 적용: 온도 = 30 ° C, 유량 0.2 mL/min, 패스의 수를 = = 8, 방향 = 받는 사람, 참조 및 노즐 거리 = 40 m m.
   참고: 매트릭스 분무기 대신 예술적인 에어브러쉬는 액체 매트릭스를 적용 사용할 수 있습니다. 같은 매트릭스 솔루션 스프레이, 사용할 수 있습니다 하지만 약 두 배나 많은 솔루션이 필요 합니다. 고정 되도록 세로로 응답 슬라이드와 슬라이드 스프레이 90 ° 각도에서 멀리 대략 1 개 발에서 (호프만¹⁵에서 적응) 매트릭스까지 레이어 표시 됩니다.
5. Calibrant의 1 µ L을 추가 (대상에 대 한 인 레드 < 500 다, 펩 티 드 혼합물 ( 재료의 표참조) 대상에 대 한 < 5000 다) 슬라이드에 명확한 자리를. 인 레드, 매트릭스와 혼합 되지 않음 필요 하지만 펩 티 드 혼합물을 이온화를 돕기 위해 매트릭스와 1:1 혼합물. Calibrant 건조 기다립니다.
6. X를 그리기는 슬라이드의 각 모서리에 영구 마커를 사용 하 고 1200 dpi에서 카메라 또는 스캐너를 사용 하 여 광학 이미지.

5. 영상 질량 분석 데이터 수집

1. IMS 데이터 분석 소프트웨어에 새로운 시퀀스를 엽니다 ( 재료의 표참조). 원하는 해상도, 50 µ m 래스터 폭을 설정 합니다.
2. 슬라이드의 광학 이미지 분석 소프트웨어를 업로드 하 고 설정된 3에서 교차로 사용 하 여 가르쳐는 x의 각 모서리에 그려진.
3. 영상 수집 소프트웨어에 대 한 관심 영역을 지정 하 고 그에 따라 그들의 이름을.
4. 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 악기를 보정 ( 재료의 표참조) 5 ppm 오류 내.
5. 최적화 된 메서드를 저장 하 고 실행을 시작 합니다. 이 실험 다음 매개 변수를 최적화: 극성 = 긍정, 검출기 Reflectron, 레이저 크기 = 2, 레이저 파워 = = 50%, 반사 모드 탐지기 이득 = 3 x.

6. 처리 IMS 데이터

1. 통계 소프트웨어에.mis 파일 가져오기 ( 재료의 표참조) 의미의 분석을 위해.

결과

최적으로 말린된 이토 슬라이드와 평면 desiccated 샘플 귀 착될 것 이다 agarose와 agarose 조각을 슬라이드 (그림 3)에서 공간 별거를 유지 하는 표면에서 주름을 최소화. 그림 3A 보여줍니다 최적의 건조, 그림 3B 보여 주름을 피해 야 한다. 이 최적화에 주의 상대 습도에 따라 정확한 시간 수 다를 오븐에서 슬라이드의 모니터링이 필요 합니다. 주름을 약간 높이 영향을 미칠 수 따라서 IMS의 대량 정확도 신호 하는 동안 약간의 주름 데이터의 품질을 영향 하지 않습니다. 따라서, 궁극적으로 약간의 주름을가지고 어떤 agarose 여전히 MALDI TOF MS를 통해 분석할 수 있습니다. 슬라이드를 완전히 건조 해야 합니다 또는이 MALDI TOF 질량 분석기의 높은 진공 환경에서 샘플의 폭발...

토론

HGSOC^12,,1718, norepinephrine의 역할 연루 증거의 성장 시체 이며이 기술은 더 기계 정보를 기여 하고있다. 생물 학적 조건 같은 슬라이드에 적어도 8, 메서드 단일 IMS에 미디어 컨트롤 뿐만 아니라 유전자와 세포 특이성 run과 같은 생물 학적 컨트롤에 대 한 계정 수 있습니다. 메서드가 최적화 되었습니다 동안 평가 하 교환 HGSOC, 모든 셀에에서 기본 전이 모델에서 작은 분자 또는 조직 유형 agarose에 배치할 수 있는 다양 한 생물 학적 질문 및 질병 상태를 분석 하 대용 될 수 있다.

프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 조직 또는 세포 유형 서로 게 가까운 근접에서 고 agarose 플러그의 중심에 존재 하도록은. 또 다른 중요 한 고려 사항은 전체 슬라이드에 대 한 건조...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL Falcon tubes	Denville	C1017-O	세포를 수집하기 위해
8-웰 챔버 (Millipore EZ-slide 챔버)	Millipore	PEZGS0816	Millipore Millicell EZ-slide 챔버 슬라이드에서 용도 변경
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998-4L	스프레이 매트릭스용 용매
알파 최소 필수 매체 (α MEM)	Fisher	10-022-CV	세포 배양 배지
Autoflex speed MALDI-TOF LRF	Bruker		IMS 데이터 분석용
원심분리기	Eppendorf	5810 R	세포 수집 및 상등액 제거
CHCA Matrix	Bruker Daltonic	8201344	Matrix 건조 슬라이드에 분사
DHB Matrix	Bruker Daltonic	8201346	Matrix 분사 건조 슬라이드에
일회용 메스	Fisher	22-079-707	난소 제거용
Dispirting	Scissors Fisher	13-804-6	난소 제거용
DMEM Media	Gibco	11995-065	아가로스
표피 성장 인자	Peprotech Inc.	100-15	세포 배양 배지 보충제
Eppendorf 튜브	Genesee Scientific	22-282	아가로스 부분 표본
Estradiol-17β	Simga-Aldrich	E2758	세포 배양 배지 보충제
Fetal Bovine Serum	Denville	fb5001	세포 배양 배지 보충제
FlexControl 3.4	Bruker Daltonic		IMS 데이터 수집 소프트웨어
FlexImaging 4.1	Bruker Daltonic		IMS 데이터 분석 소프트웨어
겸자 (fine)	Fsiher	22-327379	제거용 난소
Gentamycin	Cellgro	30-005-CR	세포 배양 배지 보충제
인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 (ITS)	Sigma-Aldrich	11074547001	세포 배양 배지 보충제
ITO 코팅 슬라이드	Bruker	8237001	공동 배양 배양을 위한 플랫폼
Leibovitz의 L-15 Medium	Gibco 11415064		조직 중에 사용되는 배지 dissection
L-glutamine	Gibco	25030-081	세포 배양 배지 보충제
저융점 아가로스	Sigma-Aldrich	A9414-10G	도금용 매체와 혼합
배지 분지	Corning	4870	분할 챔버용 플라스틱 칸막이를 절단하는 데 사용
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140-122	세포 배양 배지 보충제
펩타이드 보정 표준	Bruker Daltonic	8206195	중간 질량 범위에 대한 보정
포포러스 레드	Sigma-Aldrich	343-242-5G	낮은 질량 범위에 대한 보정
SCiLS Lab 2015	Bruker Daltonic		IMS 데이터 통계 분석
외과 겸자 (무딘)	Fisher	08-875-8B	난소 제거
TFA	Fisher 매트릭스	솔루션에 추가된	A116-50
TM 분무기	HTX 기술		매트릭스 적용용