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방법 논문

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

36K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59519

⸱

2019년 5월 16일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

배양 된 일차 또는 확립 된 세포 주는 일반적으로 동물 모델을 사용 하기 전에 초기 접근법으로 서 근본적인 생물학적 및 기계적 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 아연 (Zn) 및 원자 흡 광도 분광학이 있는 다른 미 량 원소 연구를 위해 전체 세포 추출 물과 세포 분 획을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

초록

전이 금속은 유기 체에 필수적인 미 량 영양소 이지만 단백질의 생리 금속과 경쟁 하 고 산화 환 원 스트레스를 발생 시켜 높은 농도로 세포에 독성이 있을 수 있습니다. 금속 고갈 또는 축적으로 이끌어 내는 병리학 적 상태는 다른 인간적 인 질병의 인과 대리인입니다. 몇몇 예는 빈혈증, acrodermatitis enteropathica, 및 윌슨의 그리고 Menkes의 질병을 포함 합니다. 따라서 이러한 요소가 정상적인 생리 적 기능에 기여 하는 방법을 탐구 하는 연구를 용이 하 게 하기 위해 높은 민감도와 정확성을 가진 생물학적 시료에서 전이 금속의 수준과 수송을 측정 할 수 있어야 하는 것이 중요 합니다 독성. 아연 (Zn)은 예를 들어 많은 포유류 단백질의 보조 인자이 고, 신호 전달에 관여 하며, 세포에서의 이차 메신저 이다. 과잉에서, Zn은 독성이 며 다른 금속의 흡수를 억제할 수 있으며, 적자 상태에서는 잠재적으로 치명적인 다양 한 조건으로 이어질 수 있습니다.

흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 다양 한 생물학적 샘플에서 Zn 및 기타 전이 금속 농도를 결정 하는 매우 민감하고 효과적인 방법을 제공 합니다. GF-AAS를 통한 전기 열 분무는 관심 요소의 여기 파장을 사용 하 여 후속 선택적 흡수 분석을 위해 소량의 시료를 분무 하 여 금속을 정량 합니다. 맥주-램버트 법칙의 선형성의 한계 내에서, 금속에의 한 빛의 흡 광도는 분석 물의 농도에 정비례 합니다. Zn 함량을 결정 하는 다른 방법에 비해, GF-AAS는 작은 샘플 용적에서 고감도의 작은 세포내 분자와 단백질의 무료 및 복합 Zn을 모두 검출 합니다. 또한, GF-AAS는 유도 결합 플라즈마 질량 분 광 법 (ICP) 또는 싱크 로트 론 기반 X 선 형광 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 방법에서는, GF-AAS에서 분석을 위해 상이한 배양 된 세포 주 들의 체계적인 샘플 준비가 기재 되어 있다. 이 미 량 원소의 변이는 전체 세포 용 해물과 증식 및 분화 된 세포의 소 세포 분 획을 원리의 증거로 서 비교 하였다.

서론

아연, Cu, Mn 및 Fe와 같은 전이 및 중 금속은 식품 및 오염 물질의 두 영양소 모두에서 자연적으로 발견 됩니다. 모든 살아있는 유기 체는이 미 량 영양소의 다른 양을 요구 합니다; 그러나, 높은 수준에 노출은 유기 체에 해로운. 금속 수집은 주로 다이어트를 통해, 하지만 금속은 또한 피부를 통해 흡입 또는 흡수 될 수 있다1,2,4,5. 대기 입자에 있는 금속의 존재가 증가 하 고 건강 위험과 크게 연관 되어 있다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 인위적인 활동으로 인하여 Ag와 같은 중 금속의 증가 된 수준, 예컨대 Cd, Cr, Hg, Ni, Fe 및 Pb는 대기 미 립 자 물질, 빗 물 및 토양6에서 검출 되었다. 이러한 금속은 필수 생리 적 미 량 원소, 특히 Zn과 Fe와 경쟁할 가능성이 있으며 생물학적 과정에 대 한 기본 효소를 비활성화 하 여 독성 효과를 유발 합니다.

미 량 원소 Zn은 산화 환 원 중성 이며, 포유류 단백질8,9의 10% 이상에서 단백질 폴딩 및 촉매 활성에 필요한 근본적인 보조 인자를 만드는 생물학적 반응에서 루이스 산으로 서 동작 하며, 10; 따라서 다양 한 생리 기능8,11에 필수적입니다. 그러나, 많은 미 량 원소 처럼, 정상적인 생리 기능을 촉진 하 고 독성을 일으키는 이러한 금속 사이의 섬세 한 균형이 있다. 포유류에서, Zn 결핍은 빈 혈, 성장 지연, hypogonadism, 피부 이상, 설사, 탈모 증, 맛 장애, 만성 염증 및 장애인 면역 및 신경 기능 장애를 야기 한다11,12, 16,17,18. 과량으로, Zn은 세포 독성을 가지 며 구리19,20,21등의 다른 필수 금속의 흡수를 저해 한다.

추가적으로, Cu와 Fe와 같은 몇몇 금속은 유해한 반응에 참여할 가능성이 있습니다. 펜 톤 화학을 통한 반응성 산소 종 (ROS)의 생산은 철 황 클러스터 단백질의 조립을 방해 하 고 지질 대사22,23을변경할 수 있습니다. 이 손상을 방지 하기 위해, 세포는 독성 효과를 방지 하기 위해 금속 결합 샤 페론 및 전송기를 활용 합니다. 의심 할 여 지 없이, 금속 항상성 특정 세포 유형이 금속의 적절 한 수준을 유지 하기 위해 엄격 하 게 제어 해야 합니다. 이러한 이유로 생물학적 시료에서 미 량 금속을 정확 하 게 측정 하기 위한 기술을 발전시키는 데는 상당한 필요성이 있습니다. 발달 하 고 성숙한 유기 체에서 세포 수준, 다른 발달 단계 및 정상 및 병리학 적 조건에서 미 량 원소에 대 한 차등 생물학적 필요성이 존재 합니다. 따라서, 조직 및 전신 금속 레벨의 정밀한 결정은 organismal 금속 항상성 이해에 필요 하다.

흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 작은 시료 부피에 사용 되는 고감도 기술로 서 생물학적 및 환경적 시료에 존재 하는 전이 및 중 금속을 측정 하는 데 이상적입니다25,26 , 28 , 28. 또한, 기술의 높은 감도로 인해 xenopus 를 사용 하 여 Na +/k+ATPase 및 위 H+/k+-ATPase의 미세한 수송 특성을 연구 하는 데적합 한 것으로 나타났습니다. 모델 시스템으로 서 난 모 세포 (29). GF-AAS에서, 샘플 내의 원자화 된 요소는 관심 있는 금속을 포함 하는 광원에 의해 방출 되는 방사선의 파장을 흡수 하 고, 흡수 된 방사선은 원소의 농도에 비례 합니다. 원소 전자 여기는 각 화학 원소에 대 한 고유 양자화 된 과정에서 자외선 또는 가시 방사선의 흡수에 일어난다. 단일 전자 공정에서, 광자의 흡수는 원자 내에서 더 낮은 에너지 레벨로 이동 하는 전자와 GF-AAS는 샘플에 의해 흡수 되는 광자의 양을 결정 하며,이는 방사선 흡수의 수에 비례 한다 요소는 흑연 튜브에서 원자화.

이 기법의 선택 성은 각 원소에 특정 흡수/방출 스펙트럼 라인이 있는 원자의 전자 구조에 의존 합니다. Zn의 경우, 흡 광도 파장은 213.9 nm이 고, 다른 금속과 정밀 하 게 구별할 수 있다. 전반적으로 GF-AAS는 적절 한 검출 한계 (LOD)와 고감도 및 선택성25를 사용 하 여 Zn을 정량화 하는 데 사용할 수 있습니다. 흡수 된 파장의 변화는 통합 되 고 특정 및 절연 파장에서 에너지 흡수의 피크로 제시 됩니다. 주어진 샘플에서 Zn의 농도는 일반적으로 맥주-램버트 법칙에 따라 알려진 농도의 표준 곡선에서 계산 되며, 여기서 흡 광도는 샘플의 Zn 농도에 정비례 합니다. 그러나 GF-AAS 분석에 맥주 램버트 방정식을 적용 하면 약간의 합병증도 나타납니다. 예를 들어, 샘플의 분무 및/또는 불균일 한 농도의 변동은 금속 측정에 영향을 줄 수 있습니다.

GF AAS 미 량 원소 분석에 필요한 금속 분무는 세 가지 기본 단계로 구성 됩니다. 첫 번째 단계는 액체 용 매가 증발 되는 탈 용 매입니다. 퍼니스 후 건조 화합물을 떠나는 것은 약 100 ° c의 온도에 도달 한다. 이어서, 화합물을 800 내지 1400 ° c에서가 열 하 여 기화 시켜 (분석 하고자 하는 원소에 따라) 기체가 된다. 마지막으로, 기체 상태의 화합물은 1500에서 2500 ° c 까지의 온도 범위에서 원자화 됩니다. 상기 논의 된 바와 같이, 관심 금속의 농도 증가는 GF-AAS에 의해 검출 된 흡수에 비례 증가를 렌더링 하지만, 퍼니스는 분석의 동적 범위를 감소 시킬 수 있는 농도의 작동 범위 기기에 의해 결정 됩니다. 따라서,이 기술은 낮은 농도를 요구 하 고 비어 있는 램버트 법칙의 LOD 및 선형성의 한계를 결정 함으로써 방법의 동적 범위에 대 한 신중한 결정을 필요로 한다. LOD는 물질을 검출할 때 필요한 최소 수량으로, 매트릭스에서 Zn의 표준 편차를 3 배로 정의 합니다. LOL은 맥주 램버트 법을 사용 하 여 검출 될 수 있는 최대 농도 이다.

이 작업에서는 전체 세포 추출 물, 세포질 및 핵 분 획 및 증식 및 분화 배양 세포에서 Zn의 수준을 분석 하는 표준 방법을 설명 합니다 (그림 1). 우리는 샘플 준비 중 금속 손실을 방지 하기 위해 다른 세포 시스템에 핵 프로토콜의 급속 한 격리를 조정 했습니다. 사용 된 셀룰러 모델은 마우스 위성 세포, 뮤 린 신경 모 세포종 세포 (N2A 또는 Neuro2A), 뮤 린 3T3 L1 지방 세포내, 인간 비 종양 유 방 상피 세포 주 (MCF10A) 및 상피 마 딘-다 비 개 신장 ( MDCK) 셀입니다. 이 세포는 다른 계보에서 설립 된 및 시험관에서금속 수준의 계보 특정 변화를 조사 하기 위한 좋은 모델.

마우스 위성 세포에서 유래 된 1 차 myoblasts은 골격 근육 분화를 조사 하기에 적합 한 시험관 내 모델을 구성 합니다. 이러한 세포의 증식은 높은 혈 청 조건 하에서 배양 할 때 빠르다. 근육 혈통으로의 분화는 저 혈 청 조건30에 의해 유도 된다. 뮤 린 신경 모 세포종 (N2A) 확립 된 세포 주는 마우스 뉴 럴 크레스트 로부터 유래 되었다. 이들 세포는 뉴런 및 아메바 줄기 세포 형태학을 제시 한다. 분화 자극 시, N2A 세포는 신경 필 라 멘 트와 같은 뉴런의 여러 성질을 제시 한다. N2A 세포는 알츠하이머병을 조사 하기 위해 사용 되는, 신경 근 성장, 및 신경 독성31,32,33. 3T3-L1 뮤 린 전 지방 세포는 지질 생성과 관련 된 대사 및 생리 적 변화를 조사 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 이들 세포는 섬유 아 세포 유사 형태학을 제시 하지만, 일단 분화에 자극을 주며, 지질 합성과 중성 지방 축적과 관련 된 효소 활성화를 제시 한다. 이는 세포질 지질 방울34,35을 생성 하기 위한 형태학 적 변화로 관찰 될 수 있다. MCF10A는 유 방 섬유 낭 성 질환36을 가진 폐 경전 여성에서 유래한 비 종양 유 방 상피 세포 라인 이다. 이는 증식, 세포 이동 및 침략과 같은 유 방 발암 물질과 관련 된 생화학 적, 분자 및 세포 연구에 널리 사용 되 고 있습니다. 마 딘-다가 개 신장 (MDCK) 상피 세포 주는 광범위 하 게 사용 되어 상피 표현 형의 확립과 관련 된 특성 및 분자 사건을 조사 한다. 합류에 도달 하면,이 세포는 편광 되 고 세포 세포 유착을 확립, 포유류 상피 조직의 특성37.

포유동물 세포에서의 Zn 수준을 측정 하는 AAS의 능력을 시험 하기 위해, 우리는 이들 5 개의 세포 주 들의 전체 및 세포 분 획 (사이토 졸 및 핵)을 분석 하였다. AAS 측정은 이러한 세포 유형에 서 Zn의 상이한 농도를 보여주었다. 농도는 4 개의 확립 된 세포 주 (단백질의 20에서 40 nmol/mg에 이르기까지)에서 증가 하 고 1 차적인 myob(4~7nmol/mg 단백질)의 분화에서 더 낮다. 아연 수준에서 작은 비 중요 한 증가는 세포 증식에 비교 될 때 일차 myoblasts 및 신경 모 세포종 세포를 차별화에서 검출 되었다. 분화 된 지방 세포에서 반대 효과가 검출 되었다. 그러나 3T3-L1 세포 증식은 분화 된 세포에 비해 금속의 높은 농도를 나타내 었 다. 중요 하 게도, 이러한 3 개의 세포 주에서, 세포 분별은 Zn이 이들 세포의 대사 상태에 따라 사이토 졸 및 핵에 차별적으로 분포 되어 있음을 보여주었다. 예를 들어, 증식에 있어서, N2A 세포 및 3T3-L1 사전 지방 세포, 금속의 대다수는 핵에 국한 된다. 특정 세포 처리를 사용 하 여 분화의 유도 시, 아연은이 세 가지 세포 유형에 서 사이토 졸에 국한. 흥미롭게도, 둘 다 상피 세포 라인은 특성 꽉 단층 형성 된 합류에 도달 했을 때에 비해 증식 시 Zn의 높은 수준을 보였다. 상피 세포 증식에서, 유 방 세포 주는 사이토 졸과 핵 사이에 동등한 Zn 분포를 MCF10A, 신장 유래 세포 주는 대부분의 금속이 핵에 위치 하였다. 이 두 세포 유형에 서, 세포가 합류에 도달 하면, Zn은 주로 사이토 졸에 위치 하였다. 이러한 결과는 GF-AAS가 저 수율 샘플에서 원소 분석을 수행 하기 위한 매우 민감하고 정확한 기술 이라는 것을 보여줍니다. GF-AAS는 세포 분 획과 결합 하 고 다른 세포 주 및 조직에서 미 량 금속 원소의 레벨을 조사 하도록 조정할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 포유류 세포 배양

  1. 일반 고려 사항
    1. 포유류 세포 배양에 대 한 무 균 기술에 따라 이전에 검토38.
    2. 37 ° c에서가 습 된 5% CO2 인큐베이터에서 모든 세포 주를 유지 한다. 세포 배양 조건은 각 세포 유형에 따라 달라 집니다. 사용 된 각 세포 주의 적절 한 배양 조건을 유지 하는 것이 중요 하며, 이러한 절차의 변화로 인해 세포 배양의 변종 표현 형과 실패로 이어질 것입니다.
    3. 관심 있는 셀 라인과 친분을 유지 하 고 특정 실험을 위해 선택한 각 셀 유형에 제공 된 프로토콜을 따르십시오 (아래 몇 가지 예 참조).
  2. 부착 세포의 trypsinization 및 전달에 대 한 일반 절차
    1. 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡 인에 의해 제거 한다.
    2. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS를 사용 하 여 세포를 부드럽게 씻으 세요 (10cm 당 5 mL의 배양 표면적). 플레이트의 측면에 세척 용액을 추가 하 여 세포 단층을 분리 하지 마십시오. 용액의 커버리지를 최대화 하기 위해 플레이트를 소용돌이. 상피 세포의 경우, 다음 단계에서 세포의 해리를 촉진 하기 위해 PBS에서 37 ° c에서 배양 기에서 10 ~ 15 분 동안 세포를 배양 할 필요가 있다.
    3. 흡 인에 의해 세척 용액을 제거 한다.
    4. 플레이트에 충분 한 해리 시 약 (0.25% 트립 신)을 추가 하십시오 (10cm 당약 0.7 mL). 플레이트를 부드럽게 스 월 하 여 세포 단층의 완벽 한 커버리지를 얻으십시오.
    5. 실 온에서 2 ~ 5 분간 배양 합니다. 실제 배양 시간은 사용 되는 세포 라인에 따라 다르지만, 상피 세포의 경우에는 37 ° c에서 인큐베이터에서 10 ~ 15 분 동안 배양 하는 것이 권장 된다. 세포 분리를 위한 현미경의 밑에 세포를 관찰 하십시오.
    6. 대부분의 세포가 분리 되었을 때, 미리 데워 진 도금 또는 성장 배지의 5 mL에 있는 세포 현 탁 액을 회복 합니다 (몇 가지 예는 아래 참조). 세포 단층을 여러 번 피 펫 팅 하 여 기계적으로 해리 된 세포 덩어리.
    7. 15 mL 원추형 튜브로 세포 현 탁 액을 전송 하 고 2 ~ 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리기. 원심 분리 속도와 시간은 세포 유형에 따라 달라 집니다. 세포 펠 릿을 만지지 않도록 조심 하면서 부드러운 포부로 미디어를 제거 하십시오. 적절 하 게 미리 데워 진 성장 배지의 5 내지 10ml에서 세포 펠 렛을 소생 하 고, 혈 세포 계 또는 자동 세포 카운터를 이용 하 여 카운팅 하기 위한 샘플을 제거 한다.
    8. 세포 현 탁 액의 적절 한 부피를 활용 하 여 각 특정 세포 라인에 대 한 권장 밀도를 시드합니다 (몇 가지 예는 아래 참조). 배양 접시의 크기에 따라 배양 배지를 적절 한 부피로 보충 하 고 세포를 인큐베이터에 다시 배치 한다.
  3. 마우스 위성 셀에서 파생 된 1 차 myoblasts
    1. 시작 하기 전에, 1 차 묘 블 라스트 성장을 위한 콜라겐 코팅 플레이트를 준비 하십시오. 0.02% 콜라겐을 함유 하는 용액 및 탈 이온 수 중의 0.05 M 아세트산은 0.22 µm 멸 균 필터 장치로 여과 하 여 멸 균 해야 합니다. 37 ° c에서 밤새 콜라겐 용액으로 배양 플레이트를 배양 하였다.
    2. 다음날, 콜라겐 용액을 흡 인 하 고, 플레이트를 멸 균 캐비닛에 공기 건조 시켜 사용 하기 전까지 4°c에서 보관 하십시오.
      참고: 콜라겐의 최소 볼륨은 다음과 같습니다: 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10cm = 5 mL
    3. 종자 1 차 myoblasts x 104 셀/2cm 2 에서 55 콜라겐 코팅 배양 접시. 상기 증식 배지는 Dulbecco의 변성 독수리 배지 (DMEM)/햄의 F12 영양 혼합 배양 배지를 포함 하 여 20%의 태아 소 혈 청 (FBS), 25 ng/mL의 재조합 염기 성 섬유 성장 인자 (FGF) 및 100의 페니실린/streptomycin.
      참고: 증식 및 주식 세포는 콘 유창의 50% 미만으로 유지 되어야 합니다. 세포 접촉은 myogenic 분화에 세포의 투입을 유도 하 고 배양의 성장 능력을 손상 시킵니다.
    4. 기본 myoblasts을 차별화 하기 위해, 세포가 도금의 48 h 후에 일반적으로 발생 하는 80%의 약 100%에 도달 할 수 있습니다. 그런 다음 분화 배지 (DMEM, 2% 말 혈 청, 1% 인슐린, 트랜스 페 린, 셀레늄 보충 및 페니실린/streptomycin의 100)로 변경 하십시오. 수확 할 때까지 매일 미디어를 새로 고칩니다.
  4. 뮤 린 신경 모 세포종 (N2A)
    1. N2A 세포를 성장 매체에 2 x 104 세포/2cm2 의 농도로 플레이트 하 고, 고 혈당 및 L-글루타민 (1:1, v:v)을 함유 하는 감소 된 혈 청 중간/DMEM의 혼합물을 함유 하 고, 10% FBS 및 100의 페니실린/streptomycin를 보충 한다. 재고 배양을 50% 미만으로 유지 합니다.
    2. N2A 세포의 분화를 유도 한 후에는 25 ~ 40%에 도달 합니다. 감소 된 혈 청 배지/DMEM의 혼합물을 함유 하는 분화 매체로의 변화, 1% FBS 및 7 ~ 10 일 동안 20 µ M 레 틴 산. 세포 수확까지 매일 미디어를 새로 고칩니다.
      참고: N2A 세포가 분화 함에 따라 일부 세포는 둥글게 되어 쉽게 분리 되며 아 폽 토시 스를 겪을 수 있습니다. 흡 기 및 플레이트에 배양 배지를 추가 할 때 주의 하십시오.
  5. 3T3 L1 뮤 린 지방 세포 전
    1. 10% FBS 및 100의 페니실린/streptomycin로 보충 된 높은 포도 당과 함께 DMEM에 마우스 3T3/L1 세포를 유지 하십시오. 지방 형성 과정은 세포의 합류에 의존; 따라서, 더 높은 합류는 분화 하는 세포의 능력을 손상 시킬 것 이기 때문에 주식 문화가 50% 이상 성장 하 게 하지 마십시오.
    2. 셀을 2 x 104 셀 /cm2로 플레이트 합니다. 이 밀도에서, 세포는 3 일에 합류에 도달 합니다.
    3. 세포가 100% confluency 하 게 도달한 후 2 일 후에 지질 분화를 유도 합니다. 유도 매체는 10% FBS, 10 μ g/m l 인슐린, 0.5 mM 3-이 소부 틸 methyxanthine, 1 DMEM의 덱 사 메타 손과 10 μ m troglitazone을 포함 하는 것으로 구성 된다.
    4. 48 시간 후에 유도 매체를 대체 하 여 분화 배지 (DMEM를 포함 하는 10% FBS와 5 μ g/m l 인슐린)를 배양 한다. 수확 할 때까지 매일 미디어를 새로 고칩니다. 완전 분화의 대표적인 샘플은 일반적으로 지질 유도 후 7 및 10 일 사이에 수집 된다.
      참고: 지방 형성이 진행 됨에 따라 세포가 둥글게 되어 쉽게 분리 되는 경향이 있습니다. 흡 기 및 플레이트에 배양 배지를 추가 할 때 주의 하십시오.
  6. MCF10A 세포
    1. DMEM 1:1, v:v)에서 5% FBS, 100 MCF10A 페니실린/streptomycin 0.5 µ/g 인슐린 및 20 ng/m l의 표 피 성장 인자 (EGF)로 보충 된 세포를 플레이트. 권장 시 딩 밀도는 1 x 105 셀/cm2입니다. 이러한 조건에서 세포는 4 일 이내에 100%의 유창 함에 도달 할 것입니다. 수확 할 때까지 매 2 ~ 3 일 마다 미디어를 새로 고칩니다.
      참고: MCF10A 셀은 분리 하기가 어렵습니다. Trypsinization 전에 0.5 mM EDTA를 사용 하 여 칼슘이 없는 PBS에서 37 ° c에서 10 ~ 15 분 동안 세포를 배양 하는 것이 좋습니다.
  7. 마 딘-다 위 신장 세포 (MDCK)
    1. DMEM에서 MDCK 세포를 10% FBS 및 페니실린/streptomycin의 100을 보충 했습니다. 권장 파 종 밀도는 세포가 3 일 이내에 약 100%에 도달 하는 1 x 105 세포/cm2입니다. 수확 할 때까지 매 2 일 마다 미디어를 새로 고칩니다.
      참고: MDCK 셀은 분리 하기가 어렵습니다. Trypsinization에 칼슘과 마그네슘을 함유 하지 않은 PBS에서 37 ° c에서 5 ~ 10 분 동안 세포를 배양 하는 것이 좋습니다. 세포 응집을 방지 하기 위해 세포가 분리 되기를 기다리는 동안 플라스 크를 쳐서 흔들어 플레이트를 교 교 하지 마십시오.

2. 포유동물 세포 배양 시료 준비 AAS: 전체 세포 및 세포 분별

  1. 55에 관심 있는 세포를 배양 하는2 접시. 더 작은 배양 플레이트의 사용은 GF-AAS의 검출 한계 하에서 금속의 수준으로 샘플을 산출 할 수 있습니다.
  2. 전체 세포 추출 물
    1. 진공 트랩을 이용 하 여 배양 배지를 흡 기 한다. 미디어의 모든 흔적을 제거 해야 합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS로 원하는 시간 또는 배양 조건에서 3 회 세포를 세 번 헹 구 십시오.
    2. 새로운 플라스틱 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 플레이트에서 세포를 즉시 긁어 내어 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 1 mL에. 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 전달 하 고 2000 x g 에서 2 분 동안 원심 분리 하 고 상층 액을 흡입 합니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. -20°c에서 펠 릿 샘플을 저장 하거나 2.4 단계로 진행 합니다.
  3. 세포 분별
    1. 진공 트랩을 이용 하 여 배양 배지를 흡 기 한다. 미디어의 모든 흔적을 제거 해야 합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS로 원하는 시간 또는 배양 조건에서 3 회 세포를 세 번 헹 구 십시오. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS 1 mL로 플레이트에서 세포를 긁어 냅니다.
    2. 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮겨 얼음을 보관 하십시오. 1만 x g에서 10 초 동안 원심 분리기. 세포질 및 핵 분 획의 금속 분석이 필요한 경우 핵의 급속 한 분리를 계속 합니다. 이 절차는 세포 추출39, 40에의 한 금속의 잠재적 손실을 최소화 한다.
    3. 400 μ l의 세포를 흡 인 및 소생 시켜 서 상층 액을 제거 하 고, 0.1% 비-40 (NP-40)을 함유 하는 칼슘 및 마그네슘을 포함 하는 얼음 차가운 PBS가 아닌 이온 성 세제 이다. 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 100 μ l를 전달 하 고 전체 세포 샘플로 고려 하십시오. 이 샘플의 25%를 나타냅니다.
    4. P1000 마이크로 피 펫 팁으로 얼음에 세포 서 스 펜 션을 5 ~ 10 회 피 펫 팅 하 여 핵을 분리 합니다. 상피 세포의 핵 분리는 0.5% NP-40의 농도가 필요 합니다. 세포 현 탁 액을 26 ¾ G 바늘을 통해 10 ~ 15 회 통과 시켜 세포 해리를 달성 하 고, 30 ½ 바늘을 통해 10 ~ 15 통로를 통과 시켰다.
      주: 40x 대물 렌즈를 사용 하 여 광 현미경으로 핵 완전성을 확인 하십시오.
    5. 1만 x g에서 10 초 동안 남은 세포 용 해물 현 탁 액 (300 μ l)을 원심 분리기. 상기 상층 액은 사이토 솔 릭 분 획 물을 함유 한다. 300 μ l을 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
    6. PBS 500 μ l에서 핵 분 획을 함유 하는 펠 렛을 0.1% NP-40을 함유 하는 칼슘 및 마그네슘과 함께 헹 구 고, 1만 x g에서 10 초 동안 원심 분리기. 상기 상층 액을 제거 하 고 동일한 용액의 100 μ l에 핵을 함유한 펠 렛을 소생 시켰다.
      참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은-20°c에서 보관할 수 있습니다.
  4. 3 개의 초음파 사이클 (30son/30soff, 50 kHz, 200 W)으로 세포를 분해 하 여 5 분간 41 시료의 총 단백질 함량을 정량화 합니다.
  5. 핵 (히 돌, 염색 질 remodelers, 핵 기질 단백질) 또는 시 토 졸 분 획에 특이 적인 항 체를 이용한 웨스턴 블랏에의 한 분 획 물의 순도에 대 한 품질 관리를 수행 한다 (도 2).
    참고: 금속 팁과 함께 sonicators를 사용 하지 마십시오. 이들은 금속으로 샘플을 오염 시킬 수 있습니다.

3. 원자 흡 광도 분 광 법에의 한 포유류 세포 배양 물의 전체 세포 및 세포의 소 각 부분에 대 한 Zn 함량 분석

  1. 80 ° c에서 1 시간 동안 동량의 HNO3 미 량 금속 (주의)을 사용 하 여 산 소화에 의해 세포 배양 시료 (전체 세포 또는 핵 분 획)를 광물 화 한 다음 20°c에서 밤새 한다.
  2. H2의 반응 부피의 30%를 첨가 하 여 반응을 중지한다. 시료 부피를 18 m ω의 정제 수로 500 μ l로 가져 오십시오.
    참고: HNO3 취급은 화학 안전 안경, 스플래시 보호를 위한 얼굴 방패, 장갑을 착용 하 고 적절 한 환기 (흄 후드)를 사용할 수 없는 경우 승인 된 증기 호흡기를 사용 해야 합니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플은 실 온 (RT)에서 보관할 수 있습니다.
  3. 흑연로를 장착 한 AAS에의 한 Zn 측정을 위한 표준 솔루션과 실험 시료를 준비 합니다.
    1. 표준 곡선에 사용 된 것과 동일한 일괄 처리를 통해 전체 교정을 위한 빈 솔루션으로 제공 되는, 탈 이온 수에 2%의 HNO3 솔루션을 사용 합니다. 18 m ω 정제 수에 희석 된 분석 등급 표준을 사용 합니다.
    2. 탈 이온 수에서 2% HNO3 용액을 사용 하 여 시판 되는 1000 ppm zn 재고 용액 으로부터 1000 Ppb의 zn을 제조 한다. 5, 8, 10, 15, 20 및 25 ppb를 탈 이온 수에 2% HNO3 용액으로 직접 희석 하 여 100 ppb 표준에서 작동 하는 표준 솔루션을 준비 합니다. Zn 표준 및 블랭크를 0.1% (1g/l)2 매트릭스 한정자로 준비 합니다.
      참고: Zn의 LOD는 0.01 ppb (µ/g)입니다. 표준의 농도를 증가 시켜 Zn의 선형성의 한계를 20 ppb로 판정 하였다 (도 3).
    3. 동일한 최적화 된 조건에서 표준 및 샘플 측정: 250 mL/min의 도입 유량, 20°c의 사출 온도 및 GF 온도 1800 ° c.
      주: GF 온도는 새로운 샘플 또는 표준의 주입 전에 청소 단계를 위해 2450 ° c로 증가 되었다.
    4. 램프 (C-HCL)를 20a의 전류, 213.9 nm의 파장 및 0.7 nm의 슬릿으로 최적화 합니다.
    5. 금속 함량을 결정 하기 위해 Zn 표준 곡선을 사용 하 여 광물 화 된 샘플을 측정 합니다. 작은 부피를 측정 하면, 측정 시간이 오래 걸릴 경우 샘플이 증발 할 수 있습니다. 따라서 샘플에 물을 추가 하는 것이 좋습니다. 얻어진 데이터가 LOD를 벗어난 경우, 0.01% HNO3 (분석 학년)으로 처리 된 18 m ω 정제 수로 샘플을 희석 하십시오.
      참고: 일반적으로 샘플은 500 µ L의 부피로 희석 되어 표준 곡선이 확립 된 직후에 AAS의 자동 오토 샘플러에 배치 됩니다. 필요한 볼륨은 사용자가 결정 해야 하며 농도의 최종 계산을 고려해 야 합니다. 한 번의 시도로 전체 실험의 AAS에의 한 Zn 결정을 마무리 하는 것이 좋습니다. 측정을 일시 중지 하면 큰 실험적 변화와 불일치가 발생할 수 있습니다.
  4. AAS를 통해 측정 된 Zn에서 얻은 것과 같이 ppb 측정을 몰 농도로 변환 합니다. 아연의 질량을 고려 (65.39 amu). AAS에 의해 얻어진 ppb의 양을 6339만으로 나눕니다. 세포에서 Zn 농도는 pmol 단위에서 µmol에 이르기까지 다양 합니다.
    1. 아연 (pmol 또는 µmol)에 의해 결정 된 샘플의 단백질의 초기 질량을 브래드 퍼 드 (단계 2.4)의 농도로 나눈다. 이 계산은 샘플의 단백질의 mg 당 포함 된 금속 (pmol 또는 µmol Zn)의 양을 렌더링 한다.
      참고: 금속 측정 중에 사용 되는 희석 계수를 고려 하는 것이 중요 합니다.

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결과

우리는 포유류 세포에 있는 Zn의 분 수준을 검출 하는 GF-AAS의 능력을 시험 했습니다 (그림 1). 따라서, 우리는 마우스 위성 세포 로부터 유래 된 1 차 myoblasts (신경 모 세포종 유래), 3T3 L1 (지방 세포), MCF10A 및 MDCK 세포 (개 신장 상피)를 배양 하였다. 먼저, 이러한 모든 세포 유형의 전체 세포, 사이토 솔 릭 및 핵 분 획을 분리 하 고 웨스턴 블랏으로 분 획 물의 순도를 평가 하였다 (도 2). 핵 및 시 토 졸 분 획의 마커로 서의 크로마 틴 하청업 Brg1 및 투뷜의 대표적인 면역 검출은, 각각의 원소를 수행 하는 2.3 섹션에 기재 된 부 세포 분별 프로토콜의 적합성을 입증 분석 (그림 2). 전체 세포 및 소 세포 분 획을 GF-AAS 분석을 위해 전술한 ...

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토론

원자 흡 광도 분광학은 소량의/대량 생물학 견본에 있는 Zn 정량화를 위한 높게 과민 한 방법입니다. Zn 측정의 최적화는이 방법을 간단 하 게 적용 하 고 이상적인 분석 조건을 보장 합니다. 여기에서 GF-AAS를 사용 하 여, 우리는 다양 한 세포 주 로부터, 세포 및 핵 분 획에서, 그리고 전체 셀에서 Zn의 농도를 결정 했다. 결과는이 기술이 형광 프로브 및 ICP에 의해 얻어진 것과 비교 하 여 렌더링 한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 여러 형광 프로브는 0.1 ~ 300 pM 범위의 불안정 한 미토 콘 드리 아 Zn 수준을 보여 주었고, 골 지의 수치가 피코 몰 범위 아래에 있었고, 소포체는 800에서 5000 pM42에 이르기까지 수준과 일치 합니다. 사이토 졸 분 획에서 검출. 더욱이, zn-반응성 형광 단-3은 MCF10A 및 C2C12 43 세포에서의 작은 세포 소 낭에서 불안정 한 zn의 축적을 나타내 었으 며,이는 또한 세포질에서의 zn 정량과 일치 하는 44 이...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 T.P.에 매사추세츠의과 대학에서 교수진 다양성 학자 상을 지원 했다. N.N.. 는 SEP CONACYT, 보조금 279879에 의해 지원 됩니다. J. g. N은 국립 과학 재단 보조금 DBI 0959476에 의해 지원 됩니다. 저자는 N2A 셀 라인을 제공 하기 위한 닥터 다 릴 a. 보스코와 그녀의 기술 지원에 대 한 다니엘 라 창 Ussu에 감사 드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma AldrichI5879
Acetic AcidSigma Aldrich1005706
Anti Brg1-항체 (G7)Santa Cruz biotechnologiessc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
BradfordBiorad5000205
덱사메타손, 시그마 알드리치D4902
둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
둘베코의 변형 이글 배지/영양 혼합물(DMEM/F12)ThermoFischer-Gibco11320033
Dulbecco의 인산 완충 식염수(DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
역학 성장 인자 (EGF)Sigma AldrichE9644
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
섬유 아세포 성장 인자 - 염기성 (FGF) (AA 10-155)ThermoFischer-Gibco PHG0024
호스 세럼ThermoFischer-Gibco16050122
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
과산화수소(H2O2)Sigma Aldrich95321
인슐린Sigma Aldrich91077C
인슐린-트랜스페린-셀레늄-AThermoFischer51300044
질산(HNO3)Sigma Aldrich438073
Nonidet P-40 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (Reduced Serum Media)ThermoFischer-Gibco31985070
페니실린-스트렙토마이신ThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (콜라겐)Advanced BioMatrix5005
레티온산시그마 알드리치PHR1187
트로글리타존시그마 알드리치648469-M
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드ThermoFischer-Gibco25200056
아연(Zn) 순수 단일 원소 표준물질, 1,000 &마이크로; g/mL, 2% HNO3Perkin ElmerN9300168
Established Cell Lines
3T3-L1American Type Culture CollectionCL-173
MCDKAmerican Type Culture CollectionCCL-34
MCF10AAmerican Type Culture CollectionCRL-10317
N2AAmerican 유형 배양 컬렉션CCL-131
Equipment
Atomic Absortion 분광 광도계PerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200
, ,

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