초기 개발 중 바다 말미잘의 지질 형질이

요약

이 프로토콜의 목표는 배아를 희생하지 않고 위도 동안 말미잘 성충을 유전자 형화하는것입니다.

초록

여기서 설명된 PCR-기반 프로토콜은 동물의 생명을 희생시키지 않고 안토조안 성충성 네마토스텔라 의 기압기 배아를 유전자형화한다. 체외 수정 및 탈 젤리에 이어, zygotes는 초기 - 중간 gastrula 단계에 도달하기 위해 실온에서 24 시간 동안 개발할 수 있습니다. 가스트룰라 배아는 다음 해수를 포함하는 페트리 접시에 아가로즈 젤 침대에 배치됩니다. 해부 현미경의 밑에, 텅스텐 바늘은 외과로 각 태아에서 aboral 조직 단편을 분리하기 위하여 이용됩니다. 수술 후 배아는 치유하고 개발을 계속할 수 있습니다. 게놈 DNA는 단리된 조직 단편으로부터 추출되고 궤적 특이적 PCR에 대한 템플릿으로서 사용된다. 유전자형은 PCR 제품의 크기 또는 대문자 특정 PCR 제품의 유무에 따라 결정될 수 있습니다. 수술 후 배아는 유전자형에 따라 분류됩니다. 전체 지질 형질 검사 과정의 기간은 선별 될 배아의 수에 따라 다르지만 최소한 4-5 시간이 필요합니다. 이 방법은 배아의 유전이 종족적인 인구에서 녹아웃 돌연변이를 확인하고 발달 도중 표현형의 분석을 가능하게 하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서론

Cnidarians는 해파리, 산호 및 바다 말미잘을 포함하는 동물의 다양한 그룹을 나타냅니다. 그(것)들은 세포외 매트릭스 (mesoglea)에 의해 분리되는 외엽과 내배엽으로 구성된 diploblasts입니다. Cnidaria는 초파리와 무스와 같은 전통적인 동물 모델이 1에 속하는 Bilateria를추측하는 자매 그룹입니다. 또한, Cnidaria-Bilateria 발산은 캄브리아기 이전 기간에 발생 한 것으로 생각된다². 이와 같이, cnidarians와 양자학자의 비교 연구는 그들의 가장 최근의 일반적인 조상의 생물학에 대한 통찰력을 얻기 를 위해 필수적입니다. 최근, 비교 유전체학은 cnidarians와 양자학자가 노치와 bHLH와 같은 많은 발달 툴킷 유전자를 공유한다는 것을 밝혔습니다, 그들의 일반적인 조상이 이미 이 유전자3가 있었다는 것을 암시하. 그러나, Cnidaria와 Bilateria의 마지막 일반적인 조상에 있는 이 발달 공구 키트 유전자의 역할은 비교적 적게 잘 이해됩니다. 이 문제를 해결하기 위하여는, 이 깊이 보존한 유전자가 cnidarians에 있는 어떻게 작동하는....

프로토콜

1. 산란 유도, 체외 수정 및 탈 젤리

1. 16 °C에서 어둠 속에서 천 (ppt)당 12 부분의 염분으로 바닷물에 Nematostella 정맥스텐시스를 유지, 매일 아르테미아를 공급.
2. 산란 유도 전날, 동물을 온도 및 조명 제어 인큐베이터에 놓습니다. 인큐베이터를 프로그래밍하여 동물이 25°C에서 8시간의 빛에 노출되도록 합니다. 선택 사항: 굴의 작은 조각(&1 mm 3)을 개별 동물에게 먹이고 산란을 향상시키기 위해 인큐베이터에 넣습니다.
3. 동물을 16°C에서 1시간 동안 인큐베이터에 둡니다.
4. 인큐베이터에서 동물을 제거하고 산란을 허용하기 위해 실온 (RT)에서 빛벤치 위에 둡니다. 산란은 일반적으로 다음 1.5-2 시간 안에 발생합니다.
5. 수컷과 암컷이 별도의 용기에 있는 경우, 여성 용기의 달걀 패키지를 정자가 들어있는 남성 용기에 넣고, 팁이 절단된 이송 피펫을 사용하여 개구부를 확대하여 계란이 기계적 스트레스로 손상되지 않도록 합니다. 전송. 계란을 적어도 15 분 동안 남성 용기에 두어 기름지게하십시오.
6. 3% 시스테인 (pH 7.4)을 함유 한 바닷물에 달걀 패키지를 페트리 접시 또는 15 mL 튜브에 담는다.....

결과

Nematostella 게놈은 neuropeptide GLWamide를 위한 전구체 단백질을 암호화하는 단 하나 궤적이 있습니다. 이 궤적에서 세 개의 녹아웃 돌연변이 대엽(glw^-a,glw^-b및 glw^-c)은이전에⁵. GLWamide 궤적에서 야생 형 알레르 (+)와 녹아웃 알레이 glw^-c를운반하는 4 명의 이형 남성 (유전자 형 : +/ glw^-c)은야생 형 알레르와 다른 녹아웃을 운반하는 이형 지푸스 암컷과 교차했습니다. 동일한 궤적에서 ^-a 를 골자(유전자형: +/glw^-a)로하여 자손을 생성한다. 자손에는 4가지 가능한 유전자형이 있습니다: glw^-a

토론

여기서 동물을 희생시키지 않고 단일 말미잘 배아를 유전자형화하는 PCR 기반 프로토콜을 기술한다. 산란 과 탈 젤리 다음, 수정된 계란은 gastrulae로 발전하는 것을 허용됩니다. 각 gastrula 배아의 복부 영역은 외과적으로 제거되고, 분리된 아포랄 조직은 후속 게놈 DNA 추출을 위해 사용되며, 나머지 수술 후 배아는 치유되고 개발을 계속한다. gDNA 추출물은 각 배아의 유전자형을 결정하기 위해 PCR 분석에 사용됩니다. 이 방법은 10,^11,및 배아의 대다수 (>90%)를 조절하고 개발하는 말미잘 배아의 경구 반쪽의 능력을 이용합니다 일반적으로 수술을 생존하고 적절한 문화 조건하에서 정상적으로 개발. 이 게노티핑 분석에 필요한 조직 양은 전체 가스트룰라 배아의 절반 미만이며, gDNA 추출 실패로 인한 부정적인 결과는 드물다(&5%). 소량의 조직만 이 것을 감안할 때, 이 게노티핑 분석에 대한 프리 가스트루라.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Drosophila Peltier 냉장 인큐베이터	Shellab	SRI6PF	산란 유도에 사용
인스턴트 오션 바다 소금	인스턴트 오션	138510
염수 새우 낭종	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-시스테인 염산염	시그마 Aldrich	C7352
표준 궤도 셰이커, 모델 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	품질 생물학	351-007-01
염화칼	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
트윈 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 대체	US Biological	N3500
Proteinase K 용액(20mg/mL), RNA 등급	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
마이크로 해부 바늘 홀더	Roboz	RS-6060
텅스텐 해부 바늘	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'
glw-a			5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'
glw-c			5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'

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