이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Cholangiopathies, extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)에 영향을 미치는 담 즙이 폐쇄 증, 기본 차 경화 담 관 염, 및 cholangiocarcinoma 포함 됩니다. 그들은 효과적인 치료 옵션이 있다. EHBD를 공부 하는 도구는 매우 제한 됩니다. 우리의 목적은 야생 유형 및 유전자 조작된 생쥐에서 쉽게 생성 될 수 있는 기관 특정, 다목적, 성인 줄기 세포 유래, 전 임상 cholangiocyte 모델을 개발 했다. 따라서, 우리는 성인 마우스 EHBDs에서 EHBD organoid (EHBDO) 문화 시스템 개발의 새로운 기술에 보고 합니다. 모델은 비용 효율적이 고 쉽게 분석할 수 있으며 여러 다운스트림 응용 프로그램. 특히, 마우스 EHBD 절연 및 단일 세포 분리, organoid 문화 개시, 전파, 그리고 장기적인 유지 관리 및 저장의 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 EHBDO를 실시간 양이 많은 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (qRT-PCR) immunohistochemistry, 형광 현미경 검사 법, 그리고 mRNA 풍부 정량에 대 한 처리를 설명 합니다. 이 프로토콜 EHBD 특정 organoids를 생산 하는 것 외에도 중요 한 장점이 있습니다. L WRN 셀에서 조건 화 된 매체의 사용은 크게이 모델의 비용을 줄일 수 있습니다. 마우스 EHBDs 사용 하 여 거의 무제한 조직을 문화 세대, 인간의 조직 달리 합니다. 생성 된 마우스 EHBDOs endodermal 조상의 표식이 있는 상피 세포의 순수한 인구를 포함 하 고 담 즙 세포 분화. 교양된 organoids 여러 통로 통해 동일한 형태를 유지 하 고 액체 질소에는 장기 저장 후 복구할 수 있습니다. 모델 담 즙 조상 세포 증식의 연구에 대 한, 약리학, 조작할 수 있으며 유전자 조작된 생쥐에서 생성 될 수 있습니다. 미래 연구는 도금 효율을 평가 하는 기능 세포 성숙, 직접 세포 분화 배양 조건 최적화 필요 합니다. 개발 공동 문화 모델과 더 생물학적으로 중립 세포 외 매트릭스의 바람직한 있습니다.
서론
Cholangiopathies는 내부-및 extrahepatic 담 즙 덕트 (EHBDs)1에 있는 담 즙 셀에 영향을 주는 불 치 만성 진보적인 장애. 기본 차 경화 담 관 염, cholangiocarcinoma, 담 즙이 폐쇄 증, choledochal cysts 같은 일부 cholangiopathies EHBDs에 주로 영향을 줍니다. Cholangiopathies에 대 한 치료의 개발 전 임상 모델의 제한 된 가용성에 의해 제한 됩니다. 또한, 이전 연구 cholangiopathies 그룹화에 초점: 간, 내부 및 EHBDs. 그러나, 내부-및 EHBDs 다른 배아 기원 있고, 따라서, 명료한 분자 병 리도 고려 되어야 한다. Intrahepatic 담 즙 덕트 intrahepatic ductal 접시와 간장 계실의 두개골 부분에서 개발, 전체 EHBDs 간 계실2의 꼬리 부분에서 개발. 그들은 또한 성인 항상성, intrahepatic 담 즙 덕트 및 EHBDs2,3peribiliary 동맥에서 Hering의 운하를 포함 하 여에 대 한 다른 조상 세포 구획에 의존. 전 임상 연구를 위한 동물 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 EHBD 절연 용 장비 및 재료의 준비
- 시드 매체 및 세척 버퍼 (자료 테이블) 50 ml에서 원뿔 관을 준비 하 고 그들에 게 사용까지 4 ° C에서 또는 얼음에 계속.
- 수술 테이블 (그림 1B)를 설정 합니다. 멸 균된 수술 도구 (그림 1C)을 준비 합니다.
- 미리 그것을 따뜻하게 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 살 균 24-잘 접시를 놓습니다.
- 얼음에 지 매트릭스의 약 수를 놓습니다. 지 매트릭스를 사용 하 여 완전히 액 화 하는 경우에.
2. EHBD 절연 및 담 즙 Organoid 문화
-
절연 및 마우스 EHBD의 단일 세포 현 탁 액의 준비
- 기관 지침에 따라 (2 개월 이상)는 성인 마우스 안락사 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 복 부 구멍 중간 접근을 사용 하 여 열....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
우리의 프로토콜 마우스 EHBD organoids는 조직 관련 성인 줄기 세포 유래의 생성을 설명 합니다. 후에 organoids 교양, 낭 성 구조 형성 빠르면 1 일 EHBD 격리 후 관찰할 수 있습니다. 섬유 아 세포와 오염 문화 생성 하는 동안 일반적으로 관찰 하지. EHBDO 도금 효율은 약 2% (2 개월 이상) 신생아 또는 성인에서 고립 된 쥐 (그림 2B). EHBD organoids의 효율성을 도금 파생 성인 쥐에서 증가에 통로 2와 남아 안정 (그림 2B)에 11%. Organoids의 대다수는 드문 "불규칙 한" organoids (그림 2C-E)와 함께 모든 구절을 통해 낭 성 형태를 보여 줍니다. Organoids 5-7 일 후 그들은 축적 intralumin.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 작품의 마우스 EHBD cholangiocytes organotypic 3 차원 모델의 생성을 설명합니다. 췌 장 세포 오염, 세균 및 곰 팡이 오염 및 피하기 위해 원심 분리 후 주의 조작 방지 하기 위해 살 균 조건의 유지 보수를 방지 하려면 세심 한 EHBD 해 부를 포함 하는 EHBDO 문화 세대의 중요 한 단계는 세포질 물자의 손실입니다. 설명된 온도 조건에 가까운 준수가 필요 합니다. 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 성인 생쥐의 EHBDs는 작은 (약 1 m m 직경; 그림 1E)는 격리 기교가 필요합니다. 해 부 현미경 해 부 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용 되는 지하실 매트릭스 알려진 및 알 수 없는 성장 요인19의 농도 로트에서 다를 수 있습니다 포함 된 생물학 매트릭스가입니다. 기술 복제, 동일한 많은 또는 약 수 지 매트릭스의 사용 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 간 질병 피나 클의 연구 상 (N.R.)에 국립 보건원, 국립 연구소의 당뇨병과 소화기를 위한 미국 협회 및 신장 질병 (N.R., J.L.M. P01 DK062041 P30 DK34933 수상)에 의해 지원 되었다. 이 방법론의 발달로 그의 도움에 감사 박사 라몬 Ocadiz-루이즈 (미시간 대학) 하 고.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| L-WRN 세포 배양 배지 | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 &마이크로; g/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid 배양 매체 | |||
| L-WRN 컨디셔닝 매체 | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-글루타민 | 10 &마이크로; l/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 설폰산, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 &마이크로; l/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 &마이크로; l/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid 시딩 배지 | |||
| Organoid 배양 배지 | |||
| 표피 성장 인자 (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) 항체, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) 항체, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) 항체, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin 항체, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin 항체, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| 2차 항체 | |||
| 488 표지된 항토끼, 당나귀 IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 표지된 항염소, 당나귀 IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 표지된 항-마우스, 염소 IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt 리포터 분석 | |||
| TopFlash HEK293 세포주 | ATCC | CRL-1573 | |
| 루시페라제 분석 키트 | 비오튬 | 30003-2 | |
| 0.05% 트립신-EDTA | 라이프 테크놀 | 25300054 | |
| 0.4% 트리판 블루 솔루션 | 라이프 테크놀 | 15250061 | |
| 추가 재료 및 시약 | |||
| Basement 매트릭스, 페놀 프리 Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco A1110501 | ||
| Cell culture 동결 배지, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µ m, 멸균) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA 추출, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| 검체 처리 젤, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| 범용 마이코플라즈마 검출 키트 | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24웰 플레이트 | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50mL 원추형 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 형광 현미경 | Nikon | Eclipse E800 | |
| 도립 현미경 | Biotium | 30003-2 | |
| 부검 트레이 | Fisherbrand | 13-814-61 |
참고문헌
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).
- DiPaola....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
