거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

요약

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.

초록

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 단세포 수준에서 세균성 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 세균 세포 배양은 자연 환경에서 세균 세포의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 기술적인 진보 때문에, 다양한 세균성 세포 기능은 밀폐된 공간 안쪽에 단세포 수준에서 드러나질 수 있습니다. GV는 양과성 지질 분자로 구성된 구형 마이크로 크기의 구획이며 세포를 포함한 다양한 물질을 보유 할 수 있습니다. 본 연구에서, 단일 세균 세포를 액적 전달 방법에 의해 10-30 μm GV로 캡슐화하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 유리 기판 상에서 지지막 상에 고정시켰다. 우리의 방법은 GV 내부의 단일 박테리아의 실시간 성장을 관찰하는 데 유용합니다. 우리는 대장균 (대장균) 세포를GV 내부의 모델로 배양했지만,이 방법은 다른 세포 유형에 적응 할 수 있습니다. 우리의 방법은 미생물학, 생물학, 생명 공학 및 합성 생물학의 과학 및 산업 분야에서 사용될 수 있습니다.

서론

단일 세포 수준에서 세균 세포의 배양은 점점 더 주목을 받고 있다. 밀폐된 공간 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하면 자형형 가변성^1,2,3,4,세포 동작^{5, 6개 , 7명 , 8개 , 9,}항생내성^10,11. 배양 기술의 최근 발전으로 인해, 단일 박테리아의 배양은 잘 칩^4,7,^8,젤 방울^{12,13과 같은....}

프로토콜

1. 액적 전달 방법에 의한 세균세포를 함유하는 GV의 제조

1. 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC, 10 mMM, 1 mL) 및 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[바이오티닐(폴리에틸레네글리콜)-2000] (비오틴-PEG-DSPE, 0.1 mM, 1 mL) 클로로폼/ 메탄올 용액 (2/1, v / v)을 하고 재고를 -20 °C에 보관하십시오.
2. 지질 함유 오일 용액의 제조
   1. POPC 용액의 20 μL과 비오틴-PEG-DSPE 용액의 4 μL을 유리 튜브에 붓습니다(도 1b(i)).
   2. 유기 용매를 기류에 의해 증발시켜 지질 막을 형성하고 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1시간 동안 건조제에 필름을 배치한다(도 1b(ii)).
      참고: 연기 후드에서 유기 용매를 증발할 필요가 있습니다.
   3. 유리 병 (그림1b (iii))에 미네랄 오일 200 μL (0.84 g / mL, 재료표)를 추가합니다.
   <....

결과

액적 전달 방법을 사용하여 단일 세균 세포를 함유하는 GV를생성하는 간단한 방법을 제시한다(도 1). 도 1a는 박테리아를 함유하는 GV의 강수량의 개략적 이미지를 나타낸다. 박테리아를 포함하는 W/O 방울은 GV를 형성하기 위하여 원심분리에 의해 기름 물 (지질 단층) 계면에 걸쳐 전달됩니다. 자당 (내부 수성 용액)과 포도당 (외부 수성 용액)의 밀도 차이는 또한 W / O 방울의 오일 - 물 인터페이스의 교차를 돕습니다. 이러한 용액 간의 농도에 약간의 차이가 있어 GV의 변형및 붕괴를 유발할 수 있기 때문에 내부 및 외부 수성 용액의 삼투압을 모니터링할 필요가 있습니다. 액적 전달 방법에 의해 세균 세포를 포함하는 GV를 제조하기 위한 플로우 차트는 도 1b에나타내고 있다. 이 절차에 따라, 단일 세균 세.......

토론

여기서, 우리는 GV 내부의 단세포 수준에서 세균 세포를 배양하는 방법을 기술한다. 이 간단한 방법은 액적 전달 방법을 사용하여 단일 세포 수준에서 세균 세포를 포함하는 GV를 형성하는 것을 포함한다. 세균 세포를 함유하는 GV를 얻기 위한 다른 접근법과 비교하여, 이 방법은 두 가지 장점이 있다: (i) 개발하기 쉽고, (ii) 샘플 용액의 작은 부피(2 μL)가 GV를 제조하는 데 필요하다. 세균세포를 함유하는 GV를 제조하기 위한 액적전달방법(20)은 고전적인 수화방법(22)과 미세유체학방법(17)보다 간단하다. 예를 들어, 고전적인 수화^{방법(22)은} GV를 제조하기 위한 간단하고 쉬운 방법이지만, GV내의 물질의 캡슐화 효율은 매우 낮고 적어도 수백 마이크로리터의 샘플이 요구된다. 최근 개발된 셀룰로오스 종이-아베트 수화(23)와 겔 보조 수화

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박토트립톤	BD Biosciences	211705
클로로포름	Wako Pure Chemicals	032-21921
커버 유리(18 × 18mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	두께 0.13– 0.17 mm
커버 유리 (30 × 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	맞춤 주문	두께 0.25– 0.35mm
데스크탑 원심분리기	하이테크	ATT101	스윙 로터 타입
양면 씰 (10 > 10 > 1 mm)	Nitoms	T4613
유리 바이알	AS	ONE 6-306-01	더럼 발효관
포도당	Wako Pure Chemicals	049-31165
도립 현미경	Olympus	IX-73
메탄올	Wako Pure Chemicals	133-16771
미세한 가열 스테이지 시스템	TOKAI HIT	TP-110R-100
미네랄 오일	Nacalai Tesque	23334-85
미니 압출기	Avanti Polar Lipids	610000
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
대물 렌즈	Olympus	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
폴리 카보네이트 멤브레인	Avanti Polar Lipids	610005	기공 크기 100 nm
sCMOS 카메라	Andor	Zyla 4.2 플러스
염화나트륨	Wako Pure Chemicals	191-01665
설탕	Wako Pure Chemicals	196-00015
초음파 욕조	AS	ASU-3D
효모 추출물	BD Biosciences	212750
0.6 mL 뚜껑 플라스틱 튜브	Watson	130-806C
1.5 mL 뚜껑 플라스틱 튜브	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린	Avanti 극성 지질	850457P	POPC
1,2-디스테아로일-sn글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000]	Avanti 극성 지질	880129P	비오틴-PEG-DSPE

ONE