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방법 논문

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

6.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59555

⸱

2019년 4월 30일

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

이 논문에서

요약

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.

초록

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 단세포 수준에서 세균성 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 세균 세포 배양은 자연 환경에서 세균 세포의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 기술적인 진보 때문에, 다양한 세균성 세포 기능은 밀폐된 공간 안쪽에 단세포 수준에서 드러나질 수 있습니다. GV는 양과성 지질 분자로 구성된 구형 마이크로 크기의 구획이며 세포를 포함한 다양한 물질을 보유 할 수 있습니다. 본 연구에서, 단일 세균 세포를 액적 전달 방법에 의해 10-30 μm GV로 캡슐화하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 유리 기판 상에서 지지막 상에 고정시켰다. 우리의 방법은 GV 내부의 단일 박테리아의 실시간 성장을 관찰하는 데 유용합니다. 우리는 대장균 (대장균) 세포를GV 내부의 모델로 배양했지만,이 방법은 다른 세포 유형에 적응 할 수 있습니다. 우리의 방법은 미생물학, 생물학, 생명 공학 및 합성 생물학의 과학 및 산업 분야에서 사용될 수 있습니다.

서론

단일 세포 수준에서 세균 세포의 배양은 점점 더 주목을 받고 있다. 밀폐된 공간 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하면 자형형 가변성1,2,3,4,세포 동작5, 6개 , 7명 , 8개 , 9,항생내성10,11. 배양 기술의 최근 발전으로 인해, 단일 박테리아의 배양은 잘 칩4,7,8,젤 방울12,13과 같은 제한된 공간 내에서 달성 될 수있다 및 물 -에 - 오일 (W/ O) 물방울 5,11. 단일 세균 세포의 이해 또는 활용을 촉진하기 위해 재배 기술의 추가 기술 개발이 필요합니다.

생물학적 세포막을 모방하는 소포는 양서류 분자로 구성된 구형 구획이며 다양한 물질을 보유할 수 있습니다. 소포는 크기에 따라 분류되며 소형 소포(SV, 직경 및 100nm), 대형 소포(LAV, lt;1 μm) 및 거대 소포(GV, >1 μm)를 포함합니다. SV 또는 ROV는 생물학적 세포막(14)에 대한 그들의친화성 때문에 약물 담체로서 일반적으로 사용된다. GV는 또한프로토셀(15) 또는 인공세포(16)의시공을 위한 반응기 시스템으로 사용되어 왔다. 생물학적 세포를 GV내로 캡슐화한 것은 17, 18, 이에 따라 반응기 시스템과 결합될 때 세포 배양 시스템으로서의 잠재력을 보여준다고17,18.

여기서, 실험 적인 절차의 비디오와 더불어, 우리는 GV가 새로운 세포 배양 용기로 이용될 수 있는 방법19를기술합니다. 박테리아를 함유하는 GV는 액적 전달 방법(20)에 의해 제조된 후 커버 유리 에 지지된 막에 고정시켰다. 우리는 실시간으로 GV 내부의 단일 세포 수준에서 세균 성장을 관찰하기 위해이 시스템을 사용했다.

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프로토콜

1. 액적 전달 방법에 의한 세균세포를 함유하는 GV의 제조

  1. 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC, 10 mMM, 1 mL) 및 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[바이오티닐(폴리에틸레네글리콜)-2000] (비오틴-PEG-DSPE, 0.1 mM, 1 mL) 클로로폼/ 메탄올 용액 (2/1, v / v)을 하고 재고를 -20 °C에 보관하십시오.
  2. 지질 함유 오일 용액의 제조
    1. POPC 용액의 20 μL과 비오틴-PEG-DSPE 용액의 4 μL을 유리 튜브에 붓습니다(도 1b(i)).
    2. 유기 용매를 기류에 의해 증발시켜 지질 막을 형성하고 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1시간 동안 건조제에 필름을 배치한다(도 1b(ii)).
      참고: 연기 후드에서 유기 용매를 증발할 필요가 있습니다.
    3. 유리 병 (그림1b (iii))에 미네랄 오일 200 μL (0.84 g / mL, 재료표)를 추가합니다.
    4. 유리 병의 개구부를 필름으로 감싸고 초음파 욕조 (120 W)에서 초음파 처리하여 적어도 1 시간 (그림1b (iii)).) 동안 초음파 처리하십시오. POPC와 비오틴-PEG-DSPE의 최종 농도는 각각 1mMM 및 0.002 mM이다.
  3. 세균 세포의 사전 배양
    1. 대장균을 1x LB 배지(효모 추출물 1g, 바토 트립톤 2g, 염화나트륨 2g)를 LB 플레이트에서 200 mL에 접종하고 37°C에서 12-14시간(하룻밤)에 배양합니다.
    2. 배양 후, 배양 액의 20 μL을 수집하고 신선한 1x LB 배지의 1.98 mL로 전달하고, 세포를 2시간 동안 다시 배양한다.
    3. 사전 배양 용액의 600 nm(OD600)값에서 광학 밀도를 확인한다(단계 1.3.2에서 제조). OD600 = 1.0-1.5의 배양 전 솔루션을 사용해야 합니다.
  4. GV의 외부 및 내부 수성 용액의 제조
    1. 1x LB 배지에 포도당을 용해하여 GV의 외부 수성 용액을 준비합니다.
    2. 스톡 포도당 용액을 1x LB 배지에서200 mM으로 희석합니다(표 1).
    3. 자당을 1lb 배지에 용해하여 GV의 내부 수성 용액을 준비합니다.
    4. 배양 전 용액(OD600 = 1.0-1.5), 자당 용액(500 mM), 및 1x LB 배지(표 1)를 혼합한다. 배양 용액의 최종 OD600 값은 0.01-0.015이어야 하며 최종 자당 농도는 200 mM이어야 합니다.
      참고: 삼투압을 피하십시오. 내부 용액과 외부 수성 용액 사이의 농도를 균형 잡을 필요가 있습니다.
  5. 세균 세포를 포함하는 물 인 오일 (W / O) 방울의 준비
    1. 지질(POPC 및 비오틴-PEG-DSPE를 함유한 미네랄 오일)을 함유하는 오일 용액의 50 μL에 GV의 내부 수성 용액 2 μL을 0.6 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브(그림 1b(iv))에 첨가한다.
    2. 튜브를 손으로 탭하여 플라스틱 튜브의 두 성분을 유화합니다(도 1b(v))).
  6. 세균 세포를 포함하는 GV의 대형
    1. 1.5mL 뚜껑이 달린 플라스틱 튜브(그림 1b(vi))에 GV의 외부 수성 용액 50 μL을 추가하고 외부 수성 표면에 지질(POPC 및 비오틴-PEG-DSPE가 있는 미네랄 오일)을 함유하는 오일 용액의 150 μL을 부드럽게 층화합니다. (그림 1b(vii)))) 이 샘플을 실온(RT, 25°C)에서 10-15분 동안 인큐베이션합니다.
    2. 파이펫을 사용하여 오일 및 수성 용액의 계면에 W/O 액적 용액(단계 1.5.2에서 제조)의 50 μL을 추가합니다(도 1b(viii)).
    3. 데스크탑 원심분리기에서 RT에서 1,600 x g에서 10분 동안 1.5 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브(단계 1.6.2)를 원심분리기(그림 1b(ix)). 원심분리 후, 피펫을 이용하여 1.5 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브로부터 오일(상부 층)을 흡인하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 수집한다(도 1b(x)).

2. GV 관찰 시스템 준비 (세균 세포 배양 시스템)

  1. 구성에 대한 작은 소포 (SV)의 준비 ng a 지원되는 이중층 멤브레인
    1. POPC 용액의 20 μL및 4 μL의 비오틴-PEG-DSPE 용액을 유리 튜브에 붓습니다(단계 1.1에서 GV 제제에 사용되는 것과 동일한 지질 조성물을 사용함).
    2. 유기 용매를 공기 흐름에 의해 증발시켜 지질 막을 형성하고 이 샘플을 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1시간 동안 건조기에 놓습니다.
    3. 유리 바이알에 1x LB 배지(GV의 외부 수성 용액)에 200 μL의 200 μL을 추가합니다.
    4. 유리 병의 개구부를 필름으로 감싸고 초음파 욕조 (120W)에서 적어도 1 시간 동안 초음파 처리하십시오.
    5. 100 nm 크기의 미니 압출기 및 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 압출 방법(21)에 의해 SV를 제조한다.
  2. 수제 챔버의 준비
    1. 양면 씰(10mm x 10mm x 1mm)에 중공 펀치가 있는 7mm 구멍을 뚫습니다.
    2. 커버 글래스(30mm x 40mm, 두께 0.25~0.35mm)에 구멍이 있는 양면 씰을 붙여넣습니다.
  3. 챔버의 구멍에 커버 유리에 지원 되는 이중 층 막의 제조
    1. 챔버의 구멍에 SV 용액의 30 μL을 추가하고 (섹션 2.2에서 제조) 30 분 동안 RT에서 배양.
    2. 파이펫팅을 통해 200 mMM 의 포도당 (GV의 외부 수성 용액)을 함유 한 1x LB 배지의 20 μL로 구멍을 두 번 부드럽게 씻으십시오.
  4. 에 GV의 고정 챔버 구멍의 커버 유리에 지원 되는 이중 층 멤브레인
    1. 10 μL의 뉴트라비딘을 GV(1 mg/mL)의 외부 수성 용액으로 구멍에 넣고 RT에서 15분 동안 인큐베이션합니다.
    2. 파이펫팅을 통해 200 mMM 의 포도당 (GV의 외부 수성 용액)을 함유 한 1x LB 배지의 20 μL로 구멍을 두 번 부드럽게 씻으십시오.
    3. 챔버의 구멍에 GV (단계 1.6.3에서 제조)를 포함하는 모든 용액을 추가하고 커버 유리 (18mm x 18mm, 두께0.13-0.17mm)로 밀봉 (그림 2b).
  5. GV 내부의 세균 세포 성장의 현미경 관찰
    1. 40x/0.6 수치 조리개(NA) 대물 렌즈가 장착된 역현미경으로 미세한 가열 스테이지 시스템을 긴 작동 거리(그림2b)로 설정합니다.
    2. 챔버를 미세 한 가열 단계 시스템에놓습니다 (그림 2b). 37°C에서 6시간 동안 정적인 상태에서 챔버 내의 세균 세포를 함유하는 GV를 배양한다.
    3. 과학적인 보완 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라를 사용하여 30분마다 GV 내부에서 세균 세포 성장의 현미경 이미지를 캡처하고 기록합니다.

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결과

액적 전달 방법을 사용하여 단일 세균 세포를 함유하는 GV를생성하는 간단한 방법을 제시한다(도 1). 도 1a는 박테리아를 함유하는 GV의 강수량의 개략적 이미지를 나타낸다. 박테리아를 포함하는 W/O 방울은 GV를 형성하기 위하여 원심분리에 의해 기름 물 (지질 단층) 계면에 걸쳐 전달됩니다. 자당 (내부 수성 용액)과 포도당 (외부 수성 용액)의 밀도 차이는 또한 W / O 방울의 오일 - 물 인터페이스의 교차를 돕습니다. 이러한 용액 간의 농도에 약간의 차이가 있어 GV의 변형및 붕괴를 유발할 수 있기 때문에 내부 및 외부 수성 용액의 삼투압을 모니터링할 필요가 있습니다. 액적 전달 방법에 의해 세균 세포를 포함하는 GV를 제조하기 위한 플로우 차트는 도 1b에나타내고 있다. 이 절차에 따라, 단일 세균 세...

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토론

여기서, 우리는 GV 내부의 단세포 수준에서 세균 세포를 배양하는 방법을 기술한다. 이 간단한 방법은 액적 전달 방법을 사용하여 단일 세포 수준에서 세균 세포를 포함하는 GV를 형성하는 것을 포함한다. 세균 세포를 함유하는 GV를 얻기 위한 다른 접근법과 비교하여, 이 방법은 두 가지 장점이 있다: (i) 개발하기 쉽고, (ii) 샘플 용액의 작은 부피(2 μL)가 GV를 제조하는 데 필요하다. 세균세포를 함유하는 GV를 제조하기 위한 액적전달방법(20)은 고전적인 수화방법(22)과 미세유체학방법(17)보다 간단하다. 예를 들어, 고전적인 수화방법(22)은 GV를 제조하기 위한 간단하고 쉬운 방법이지만, GV내의 물질의 캡슐화 효율은 매우 낮고 적어도 수백 마이크로리터의 샘플이 요구된다. 최근 개발된 셀룰로오스 종이-아베트 수화(23)와 겔 보조 수화

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 일본 의 문부과학성(MEXT)의 우수 청년 연구자(리더, 제16812285호)의 우수 청년 연구자 주도 이니셔티브(16812285호)와 젊은 과학자 연구 보조금(18K18157, 16K21034)의 지원을 받았습니다. 일본과학진흥회(JSPS)에서 M.M.까지, MEXT에서 K.K.까지 의학지원(No. 17H06417, 17H06413).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
박토트립톤BD Biosciences211705
클로로포름Wako Pure Chemicals032-21921
커버 유리(18 × 18mm)Matsunami Glass Ind.C018181두께 0.13– 0.17 mm
커버 유리 (30 × 40 mm)Matsunami Glass Ind.맞춤 주문두께 0.25– 0.35mm
데스크탑 원심분리기하이테크ATT101스윙 로터 타입
양면 씰 (10 > 10 > 1 mm)NitomsT4613
유리 바이알ASONE 6-306-01더럼 발효관
포도당Wako Pure Chemicals049-31165
도립 현미경OlympusIX-73
메탄올Wako Pure Chemicals133-16771
미세한 가열 스테이지 시스템TOKAI HITTP-110R-100
미네랄 오일Nacalai Tesque23334-85
미니 압출기Avanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
대물 렌즈OlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
폴리 카보네이트 멤브레인Avanti Polar Lipids610005기공 크기 100 nm
sCMOS 카메라AndorZyla 4.2 플러스
염화나트륨Wako Pure Chemicals191-01665
설탕Wako Pure Chemicals196-00015
초음파 욕조ASASU-3D
효모 추출물BD Biosciences212750
0.6 mL 뚜껑 플라스틱 튜브Watson130-806C
1.5 mL 뚜껑 플라스틱 튜브Sumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린Avanti 극성 지질850457PPOPC
1,2-디스테아로일-sn글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000]Avanti 극성 지질880129P비오틴-PEG-DSPE
ONE

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