스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

요약

스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.

초록

여기에서 우리는 포유류 세포 및 네 마 테 ode 난 모에 있어서의 단백질의 수 모 화 및 그들의 하위 세포 국 소화를 연구 하는 신규 한 방법을 제시 하 고 있다. 이 방법은 변형 된 스모-포착 단백질 단편, kmUTAG, Ulp1 스모 프로 테아 제 로부터 유래 된, 스트레스 내성 신진 효 모 클 루 근 균을 활용 한다. 우리는 항 체를 사용 하지 않고 다양 한 모델 시스템에서 수 모 닐 화를 연구 하기 위한 목적으로 kmUTAG의 특성을 적용 했습니다. 스모의 연구에 대 한, KmUTAG 항 체 기반 접근 방식에 비해 몇 가지 이점이 있다. 이 스트레스에 강한 스모-포착 시 약은 재조합 적으로 생산 되며, 많은 종에서 자생 하는 스모이 소 양식을 인식 하 고, 시판 되는 항 체와는 달리 무료, 비 접합 스모에 대 한 친화도를 감소 보여줍니다. 여기에 표시 된 대표적인 결과는 포유류 조직 배양 세포 및 네 마 테 오드 모 난 모에 있어서의 스모 컨 쥬 게이트의 국 소화를 포함 한다.

서론

이 방법의 목적은 재조합 스모-포착 UTAG (ULp 도메인 태그) 단백질을 사용 하 여 스모 컨 쥬 게이 터 단백질의 연구 및 분석을 용이 하 게 하기 위한 것 이다. 아래에 설명 된 바와 같이, UTAG는 스모 변성 단백질을 정화, 검출 및 시각화 하기 위한 다른 시 약과 접근법을 대신 하 여 사용할 수 있습니다. 성장 조건에 따라 세포는 스모 또는 스모 사슬로 수정 된 수백 또는 수천 개의 단백질을 함유 할 수 있습니다 (검토를 위해 커 셔 외 2006¹ 과 케르 셔 2016²). 이것은 특정 스모 변성 단백질의 기능적 분석에 대 한 상당한 어려움을 나타내며, 특히 특정 수 모 닐 화 대상의 분 획만이 실제로³개 수정 되기 때문 이다. 전사 조절, 단백질 항상성, 세포 스트레스에 대 한 반응, 유사 분열 증 및 감수 분열 시 염색 질 리 모델링이 같은 필수적인 세포 과정에서의 역할에 더하여; 이제는 스모, 스모 변성 단백질, 스모 통로 성분이 암 및 퇴행 성 신경 장애 등의 병리학에 대 한 바이오 마커로 서 잠재력을가지고 있다는 것이 충분히 명백 해지고 있다⁴

프로토콜

1. 재조합 KmUTAG-FL 스모를 사용 하 여 고정 조직 배양 세포에서 스모 검출 단백질을 포착

1. 6 웰 TC 플레이트에서 선택의 조직 배양 세포를 22 mm 원형 커버에서 70% ~ 80%까지 성장 6 웰 플레이트에서 1.2 ~ 1.8 단계를 수행 합니다.
2. DPBS (Dulbecco의 인산 완충 식 염 수가 1 mL)로 세포를 짧게 씻으십시오.
3. 고정용으로, DPBS에 희석 한 4% 파라 포름알데히드 (PFA) 용액의 신선한 용액을 준비 하십시오. 세포를 고정 하려면 DPBS에 2 mL의 4% PFA를 각 웰에 추가 하십시오. 실 온에서 20 분 동안 세포를 배양 합니다. 참고: PFA를 사용 하는 모든 단계는 실험실 안전 후드에서 수행 해야 하며 PFA를 올바르게 배치 해야 합니다.
4. 플레이트를 1 mL DPBS로 세척 하 고 5 분간 각 세척 하 여 고정 세포를 3 배 씻어 냅니다.
5. 세포 투과를 위해 DPBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용 하 여 15 분 동안 배양 합니다.
6. 플레이트를 변이 하는 동안 1 mL DPBS에서 3 배 셀을 세척 하 고, 5 분간 각 세척
7. 10s 0.1의 500 µ l 글리신 (ph 2.0)을 사용 하 여 세포를 배양 한 다음, µ....

결과

KmUTAG-fl은 재조합, mCherry 태그 스모 포획 단백질. KmUTAG-fl을 생산 하기 위해, 코 돈에 최적화 된 mCherry-kmUTAG를 pSPOT1 세균과 발현 플라스 미드에 클로닝 하였다 (도 1). 유도 후, kmUTAG-fl 단백질을 스팟 트랩에 정제 하 고, 용 출 하 고, 추후 사용 될 때까지 냉동 시켰다. KmUTAG fl의 스모 포획 활동을 보장 하기 위해, SUMO1 융합 단백질의 침전 및 강 우에 대 한 결합을 확인 했습니다 (데이터는 표시 되지 않았지만 이전 작업¹³참조).

고정 된 PNT2 세포로 배양 한 KmUTAG-fl-자이 스 Axioplan 현미경에 대 한 적절 한 필터 세트 (크로마) 및 100 배 유 액 침 목표를 사용 .......

토론

여기에서 우리는 고정 포유류 세포에서 스모의 기능적 연구를 위한 재조합 단백질 인 kmutag-fl의 사용을 소개 하 고, 선 충 생식 기를 해 부 한다. KmUTAG-fl은 기본 스모 컨 쥬 게이 터 단백질과 스모 체인을 인식 하 고 트래핑 하는 스트레스를 견 디는 팬 스모 특정 시 약입니다. 스모의 3 차 구조는 고도로 보존 되어 있기 때문에 추가 모델과 비 모델 시스템에서 스모 변형이 kmUTAG-fl 시 약으로 분석 될 수 있는 가능성이 매우 높습니다. 이와 같이, KmUTAG-fl은 전통적인 항 체 염색 프로토콜을 위한 유용한 대안적인 또는 이차 시 약을 나타낼 수 있다.

탄수화물 검출을 위한 렉 틴 뿐만 아니라 단백질의 생체 내 라벨링을 위한이 머 티 드의 뉴클레오티드 및 아핀 펩타이드를 포함 한 비 항 체 대안의 사용에 대 한 충분 한 선례가 있다 ^16,17

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액	전자 현미경 과학	30525-89-4
6웰 세포 배양 플레이트	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	마우스 단클론 항체 DPBS의 2차 항체로 사용
, 칼슘 없음, 없음 magnesium	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	마우스 단클론 항체의 2차 항체로 사용
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	50-246-93)
Electron Microscopy Sciences	17985-02	를 사용한 1.11 FLUORO-GEL	DAPI가 1 µ에 추가됨; g/mL; 2.2.5 단계
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG 시약은
Kerafast.com Oneblock Western-CL 차단 완충액	Prometheus	20-313
PBS, 인산염 완충 식염수, 10X 용액	Fisher에서 사용할 수 있습니다. BioReagents	BP3994
PNT2 세포주	Sigma-Aldrich	95012613	SV40으로 불멸화된 정상 전립선 상피.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2는 Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO 프로테아제 완충액 [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 항체 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	SUMO-2 8A2는 Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	5mM Triton
X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	DPBS/PBS(웜용)에서 0.1%에서 투과에 사용됨

DABCO 단계에서 매체 장착