생체 뇌 미세 투석과 힘과 회전을 결합 하는 뇌진탕의 소설 및 번역 쥐 모델

요약

신경 전달 물질 변경은 뇌진탕 후 발생 하 고 때로는 치명적인 장기 결과에 기여 하는 신경 기능 장애의 메커니즘. 이 쥐 모델은 미세 투액을 결합하여 생체 내 신경 전달 물질 정량화를 허용하며, 인간 두개 내 뇌 외상의 중요한 요소인 머리와 몸통의 빠른 가속 및 감속을 발휘하는 체중 투하 기술을 사용합니다.

초록

지속적인 인지 및 운동 증상은 뇌진탕/가벼운 외상성 뇌 손상의 알려진 결과 (mTBIs) 변경 된 신경 전달에 부분적으로 기인 할 수 있는. 실제로, 설치류에 있는 대뇌 microdialysis 연구 결과는 외상 다음 첫번째 10 분 안에 해마에 있는 과도한 세포외 조미료 방출을 설명했습니다. 미세 투석은 동물을 희생할 필요가 없는 동안 생체 내 신경 전달 물질 연속 샘플링의 명확한 이점을 제공합니다. 전술한 기술 이외에, 이러한 요인이 다른 많은 동물 모델에서 사용할 수 없으므로, 머리와 몸통의 빠른 가속 및 감속을 발휘하는 폐쇄 머리 부상 모델이 필요하다. 웨인 스테이트 웨이트 드롭 모델은 인간의 두개내 뇌 외상의 이 필수 구성 요소를 모방하여 떨어지는 무게를 가진 억제되지 않은 설치류의 머리에 충격을 유도할 수 있습니다. 우리의 소설과 번역 쥐 모델은 가볍게 마취 및 억제 성인 쥐, 뇌진탕 다음 세포 외 신경 전달 물질 수준의 급성 변화에, 연구 웨인 상태 체중 감소 모델과 대뇌 미세 투석을 결합합니다. 이 프로토콜에서, 미세 투석 프로브는 관심 영역으로서 해마 내부에 삽입되었고, 충격시 뇌에 삽입되었다. 해마에 있는 말단 그리고 수용체의 고밀도가 있습니다, 뇌진탕 다음 변경된 신경 전달을 문서화하는 관련 지구를 만들기. 성인 Sprague-Dawley 쥐에 적용 하는 경우, 우리의 결합 된 모델 유도 해 마 외 세포 간 조미료 농도 에서 처음 10 분, 이전에 보고 된 뇌진탕 후 증상과 일치. 이 결합된 체중 투하 모형은 이 프로토콜이 닫힌 머리 온화한 외상을 유도하기 때문에, 반복적인 두뇌 상해 이외에 뇌진탕에 초기 치료 반응을 공부하는 연구원을 위한 믿을 수 있는 공구를 제공합니다.

서론

이 방법의 목적은 뇌진탕 / 가벼운 외상성 뇌의 분자 효과의 세로 특성을 허용하면서 인간 두개내 뇌 외상의 생체 역학을 충실하게 재현하는 신뢰할 수있는 도구를 연구자들에게 제공하는 것입니다. 부상 (mTbIs). 이 방법은 뇌성 미세 투해와 웨인 스테이트 웨이트 드롭 모델을 결합하여 가볍게 마취되고 억제되지 않은 성인 쥐, 뇌진탕 다음 세포 외 신경 전달 물질 수준의 급성 변화를 문서화합니다. 이 최소 침습 방법으로, 조미료 와 같은 신경 전달 물질, GABA, 타우린, 글리신과 세린 신속 하 고 지속적으로 다음 외상, 생체 내에서 정량 화 될 수 있다, 생체 내에서, 동물을 희생 하지 않아도.

뇌진탕/mTBI는 외부 힘 메커니즘에 의해 발생 하는 뇌 기능에 영향을 미치는 병 리 생리 적 중단. 뇌진탕 /mTBI는 외상성 뇌 손상의 가장 일반적인 형태이며, 케이스1의 70-90 %를 차지합니다. 뇌진탕 다음 급성 기능 장애의 대부분은 기본 및 보조 뇌 손상에 기인 할 수있다^2,3: (1) 1 차 뇌 손상은 머리와 몸통의 급속한 가속과 감속에 의해 유도된다 이는 백래시^4,5,⁶ 및 (2) 이차 뇌 손상 동안 축축의 스트레칭 과 전단에 이어 압축에 의해 뇌 조직을 손상시키는 것은 외상에 대한 간접적인 세포 반응이다. 그것은 1 차적인 두뇌 상해 후에 일어난다 및 시간이 지남에 관찰된 모터 및 인식 손상에 있는 중요한 역할을 합니다. 많은 증상은 부상 7,^8,9 에 이어 처음 10분 동안 이전에 입증된 과도한 세포외 글루타메이트 방출과 같은 변경된 신경 전달에 기인할 수^있다. 말단 과 수용체의 그것의 높은 밀도를 감안할 때, 해마는 상해 다음 이 흥분 독성 반응에 특히 취약한 두뇌 구조물입니다. 인지 기능에 크게관여하는 10^,11,설치류의 연구는 뇌진탕과 관련된 해마 손상이 두려움 조절 및 학습 공간 메모리에 손상을 초래할 수 있다고보고^{12 , 13}. 이 방법론의 주요 목적은 웨인 스테이트 폐쇄 머리 체중 감소 절차를 사용하여 1 차 뇌 손상의 메커니즘을 충실하게 재현하고 대뇌를 통합하는 뇌진탕 / mTBI의 쥐 모델을 운동하는 것이었습니다. 현미경 투석은 생체 내에서 연구, 급성 세포 외 신경 전달 물질 뇌진탕 다음 이차 뇌 손상으로 인해 변경. 세포외 글루타민산염과 GABA의 농도는 해마에서 측정되어 우리의 방법의 대표적인 결과로 작용하였다.

이전 설치류 연구는 다양한 심각도의 부상 다음 세포 외 신경 전달 물질 수준에 급성 변화를 설명하기 위해, 이러한 오픈 두개골 체중 감소 및 제어 피질 충격과 같은 부상의 미세 투석 및 기타 모델을 결합했다 도^14,15,16,17. 그러나, 가변성의 높은 정도 이외에, 오픈 두개골 무게 강하 및 통제 된 피질 충격과 같은 모델의 번역 값은 2 가지 요인으로 인한 생태학적 타당성의 본질적인 부족에 의해 방해된다: (1) 이러한 모델은 많은 부상을 유도 스포츠 관련 뇌진탕보다 더 심한 인간에서 고통, 직접 뇌로딩을 포함 (2) 이러한 모델은 두개골 절제술 또는 개두술을 필요로, 설치류의 머리는 완전히 입체 프레임에 억제되고, 빠른 방해 머리와 몸통의 가속과 감속, 따라서 제대로 뇌진탕의 생체 역학을 재현.

미세 투석은 조미료, GABA, 타우린, 글리신 및 세린과 같은 신경 전달 물질을 샘플링하는 명확한 이점을 제공하는 최소 침습 적 방법이며, 생체 내에서 지속적으로 외상을 따르며 동물을 희생할 필요가 없습니다. 미세 투석에 의해 제공되는 장점 이외에, 웨인 주립 대학은 폐쇄 두개골 무게 드롭 모델을 개발 (다른 모델에서 오픈 두개골반대), 이는 가볍게 마취 및 억제 설치류에 mTBI의 유도를 할 수 있습니다, 따라서 머리와 몸통^(18)의빠른 가속과 감속을 허용한다. 앞서 언급했듯이, 머리와 몸통의 가속 및 감속은 이전 설치류 mTBI 모델이 해결하지 못했다는 인간에서 볼 수있는 스포츠 관련 뇌진탕의 핵심 생체 역학적 특징입니다. 체중 감소 절차는 매우 신속하게 수행 할 수 있으며 사전 수술이나 두피 절개가 필요하지 않습니다. 뇌진탕의 유도 후, 설치류는 거의 자발적으로 오른쪽 반사를 복구하고 단일 충격 후 마비, 발작 또는 호흡 곤란을 경험하지 않습니다. 두개내 출혈과 두개골 골절은 드물며, 설치류에서 모터 조정에 있는 사소한 적자만 보고되었습니다. 이 쥐 모델은 사용하기 쉽고 저렴하며 충격 동안 미세 투석 프로브를 제거하지 않고 뇌진탕 다음 급성단계에서 방출된 신경 전달 물질의 정량화를 용이하게 한다.

미세 투석과 뇌진탕을 결합한 우리의 쥐 모델은 뇌진탕의 분자 효과를 세로로 특성화하려는 연구진에게 적합하며 다양한 치료 연구에서 사용될 수 있습니다. 실제로, 수년간의 연구와 압도적인 필요에도 불구하고, 뇌진탕의 장기적인 효과를 막을 수 있는약물은 임상 시험 19상을 통과하지 못했다. 이러한 실패에 대 한 잠재적인 이유 중 하나는 충실 하 게 인간에 의해 경험 으로 뇌진탕의 외상성 생체 역학 힘을 재현 하지 않는 동물 모델의 사용 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 1차 뇌 손상이 머리와 몸통의 급속한 가속 및 감속뿐만 아니라 무딘 충격에 의해 유도되는 것을 지정하는 인간 뇌진탕의 정의를 충족,^3.

또한, 우리의 결합 된 모델은 반복 가벼운 외상성 뇌 손상의 효과를 연구하는 연구자에게 적합 (rmTBI) 뇌진탕의 다른 동물 모델과 차별화하는 주요 특성 중 하나는 유도 할 수 있다는 것입니다. 반복, 같은 경우에 가벼운 부상¹⁸. 인간에서, rmTBI는 더 가혹한 외상 후 증상과 연관, 더 긴 복구 시간, 악화 모터와 인지 장애는 시간이 지남에 확산하는 경향이^20,21. 다른 관련 동물 모델은 rmTBI^{22,23,24,25,26,}27의 외상 후 병리생리학을 더 잘 이해할 수 있게 했습니다. . 24 시간 간격으로 최소 5 mTBI 후 설치류에서 증가 된 뇌 취약점이 입증되었습니다. 신경염증은 mTBI의 수가 증가함에 따라 증가하고 신경변성의 마커는^28로나타난다. 반복된 mTBI는 전염증성 모드에서 정상적인 회복 모드로 마이크로글리아의 전환을 방지하고, 장기간 의 외성 독성 활동 및 신경 퇴행성 메커니즘의 활성화를 초래한다 ^29. 우리의 모형으로, 쥐는 총 5노출을 위한 1 주일의 기간 동안 1 개의 충격에 노출될 수 있었습니다. 이러한 동물 모델의 단순성 감안할 때, mTBI 직후에 발생하는 급성 무차별 신경전달물질 방출의 누적 효과의 특성화를 용이하게 할 수 있다.

이 모델은 또한 동물이 하루에 2 개의 충격에 쉽게 노출 될 수 있게하여 운동 선수가 첫 번째 타격^30에서짧은 시간 내에 또 다른 외상성 충격을받을 때와 같은 더 심각한 조건을 연구 할 수 있게합니다. 이전 연구 31에서 입증 된 바와 같이, 머리에 두 번째 타격의 타이밍은 극적으로 혈관과 축색 손상에 영향을 미칠 수 있습니다. 두 번째 타격이 첫 번째 타격에 가까울수록 결과를 더 손상시게 됩니다. 이 모델은 이 특정 조건이 세포외 신경 전달 물질 방출에 미치는 영향을 조사하는 데 적합합니다.

이 방법에서는, 해마는 뇌진탕 연구에서 그것의 관련성 때문에 관심의 지역으로 이용되었지만 microdialysis 견본은 관심의 그밖 지구에서 또한 집합될 수 있습니다. 그러나, 다른 뇌 영역은 가이드 캐뉼라로부터 충격 부위에 의해 남겨진 공간을 고려하여야 하며, 이를 둘러싼 치과 시멘트를 포함하여, 쥐의 머리에 상당한 양의 공간을 차지할 수 있다. 이 외에도, 멤브레인의 분자량 차단 및 활성 길이, 샘플링 시간 간격 및 유량과 같은 이 방법에 제시된 미세 투석 파라미터는 연구된 분자의 유형에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어 뇌진탕에 관여하는 염증성 사이토카인의 효율적인 수집은 훨씬 더 큰 기공 크기의 멤브레인이 필요합니다.

프로토콜

이 프로젝트의 동물 프로토콜은 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 호피탈 뒤 사크레 쾨르 드 몬트리올의 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다.

참고: 연구 프로토콜의 개략적 개요는 그림1에 제시되어 있습니다.

1. 동물 준비

1. 표준 실험실 동물 공급 업체에서 Sprague-Dawley 쥐를 주문 43 그리고 50 나이의 일 사이 와 151 그리고 200 g 사이 무게에 전달.
2. 모든 쥐를 12:12 h 의 주기로 개별적으로 채우세요: 어둠, 24-26°C에서 물과 음식에 대한 광고 리비텀 접근.
3. 프로토콜을 시작하기 전에 2 주 동안, 연구원과 접촉하는 그들의 습관을 촉진하기 위해 매일 5 분 동안 쥐를 처리합니다. 쥐는 대략 10 주 오래되어야 하고 그들의 무게는 뇌진탕 또는 sham 상해 유도의 때에 295그리고 351 g 사이이어야 합니다.

2. 미세 투석 가이드 캐뉼라 이식 수술

1. 멸균 조건하에서 수술을 수행하십시오. 시술 내내 멸균 장갑, 헤어 보닛 및 수술 용 마스크를 착용하십시오. 모든 재료와 수술 기구를 사전에 오토클레이브하고 살균하십시오. 에탄올 용액 (70 %)으로 작업 영역과 입체 장치를 철저히 청소하고 소독하십시오.
2. 케타민 (70 mg /kg)과 자일라진 (10 mg / kg)의 칵테일을 복강 내로 주입하여 동물을 마취시다. 발가락 핀치에 반사를 테스트하여 마취 깊이를 나귀.
3. 전기 클리퍼를 사용하여 동물의 머리에서 털을 제거합니다. 2% 이소프로필 알코올과 2% 클로르헨시딘 글루코네이트(3회)의 용액을 사용하여 머리를 깨끗하게 면도했습니다. 마취 중에 윤활제 눈 연고를 적용하여 건조를 방지하십시오.
4. 동물의 머리만 노출되도록 수술장을 드레이프 오프. 쥐의 머리를 입체 적 장치에 넣고 귀바를 외이도에 삽입한 다음 코 클램프를 조입니다. 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라를 스테레오택시 장치의 홀더 암에 고정합니다.
5. 부피바카인(1.5 mg/kg)과 리도카인(1.5 mg/kg)의 마취 칵테일을 절개 10분 전에 머리에 피하로 주입합니다.
6. 이소플루란 나트륨(2.5%)을 전달하여 전체 시술 기간 동안 마취 유지 코 콘으로 0.5 L / 분 산소 흐름에서.
7. 메스로 두피를 따라 중간 선 절개 (3cm)를 합니다. 절개 주위에 4 개의 클램프를 설치하여 두개골을 깨끗하게 하십시오.
8. 브레그마와 람다 봉합사가 보일 때까지 수술용 블레이드로 두개골의 골막을 단단히 긁어냅니다. 출혈이 있는 경우 거즈 패드 또는 면 팁 어플리케이터로 두개골에 단단한 압력을 유지하십시오.
9. Bregma와 Lambda 봉합사의 등간 좌표를 비교하여 두개골이 입체 장치에 올바르게 정렬되어 있는지 확인하십시오. Bregma 봉합사의 전방, 절경 및 등반 좌표를 가이드 캐뉼라 좌표의 기준점으로 식별합니다.
10. Bregma 봉합사 좌표를 참조로 사용하여 해마에서 가이드 캐뉼라 이식 부위의 좌표를 계산합니다.
    참고: 이하의 좌표는 팍시노스와 왓슨으로부터의 랫트 뇌 지도에 따라 결정되었다(전방: -0.60 cm; 절경: ±0.58 cm; 등도: -0.16 cm, 도 2A)^32.
11. 마커를 사용하여 정확한 이식 부위를 표시합니다.
12. 가이드 캐뉼라의 대상 부위에 두개골을 통해 0.5 mm 구멍을 뚫습니다. 드릴 3 다른 구멍 약 5 mm 이 지점 주위 나사 3 아크릴 치과 시멘트 가해 후 캐뉼라를 응고 하는 두개골에 앵커 나사.
13. 캐뉼라를 해마에 삽입하고 치과 시멘트로 고정하십시오. 이 캐뉼라는 미세 투석 시술 중 7일 후 관심 부위에 프로브를 삽입하는데 사용됩니다. 무게가 떨어질 부위 주변에 과도한 치과 시멘트를 흘리지 않도록주의하십시오.
14. 시멘트를 2 분 동안 건조 한 다음 캐뉼라에서 홀더 암을 제거하십시오. 뇌척수액 의 침투 및 감염의 위험을 피하기 위해 캐뉼라에 스테인레스 스틸 제거 가능한 폐체를 삽입하십시오.
15. 4 개의 클램프를 제거하고 철회 된 피부를 당기고 수술 용 봉합사 4-0으로 스티치하십시오.
16. 장치에서 쥐를 제거하고 통증을 치료하기 위해 피하로 buprenorphine을 주입 (0.05 mg / kg, 수술 후 다음 2 일 동안 하루에 한 번). 설치류를 의식이 될 때까지 가열 패드가 있는 케이지에 다시 놓고, 면밀한 모니터링 하에 7일 의 회복 기간 동안 동물 보호 시설로 되돌리라.

3. 미세 투석 절차

1. 미세 투석 절차를 수행하는 동안 멸균 장갑, 헤어 보닛 및 수술 용 마스크를 착용하십시오. 캐뉼라 이식 수술 후 7일, 이소플루란 나트륨으로 쥐를 마취(2.5%) 0.5 L /min 산소 흐름에서.
2. 캐뉼라에서 난체를 제거하고 천천히 삽입 미세 투석 프로브, 인공 뇌척수액과 함께 관류 (26 mmol / LNaHCO 3, 3 mmol / L NaH2 PO_4,1.3 mmol / L MgCl₂, 2.3 mmol / L CaCl₂, 3.0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0.2 mmol/L-아스코르브 산), 캐뉼라를 통해 해마 또는 기타 관심 영역으로.
   참고: 쥐는 obturator를 제거하고 미세 투석 프로브를 삽입하는 동안만 마취 될 필요가, 뇌진탕 이나 가짜 부상의 유도 하는 동안. 여기에 사용되는 프로브는 실험실 에서 제작, I 모양, 융합 나란히 실리카 입구 출구 라인 [내부 직경 (ID): 50 μm] 폴리에틸렌 튜브에 싸여 구성 (ID: 0.58-0.38 mm). 캐뉼라의 단부는 재생된 중공 셀룰로오스 막[분자량 컷오프: 13 kDa, 외경(OD): 216 μm의 길이로 고정된다; ID: 200 μm] 시아노아크릴레이트 접착제및 에폭시로 밀봉된 팁을 사용한다. 활성 막은 해마에 이식하기 위해 2.5 mm를 측정하지만 관심 영역의 깊이에 따라 조정할 수 있습니다. 쥐의 주식 캐뉼라를 프로브에 연결하는 것은 장착 된 나사 스테인레스 스틸 칼라로 고정됩니다.
3. 프로브 어셈블리를 액체 회전에 묶은 스테인리스 스틸 스프링에 고정하고 케이지 위에 고정된 카운터 밸런스 레버 암을 링 스탠드와 클램프로 고정하여 동물이 케이지 내에서 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다. 테더형 쥐는 물과 음식에 대한 광고 리비텀 접근과 함께 미세 투석 절차의 전체 기간을 보냅니다.
4. 미세 주입 펌프를 사용하여 프로브에 이향수를 보내고 융합 된 실리카 출구 라인 (죽은 부피 : 0.79 μL)에서 투석을 수집하십시오.
5. 절차가 시작되기 최소 1 시간 30 분 전에 프로브를 작동 유량 (1 μL / min)으로 돌립니다. 파이펫으로 시간에 따른 부피를 측정하여 프로브의 유량이 일치하는지 확인합니다.
   참고: 유량은 샘플링된 신경 전달 물질 및 관심 있는 뇌 영역에 따라 다소 달라질 수 있습니다. 투석 견본은 뇌진탕 또는 sham 상해 유도 의 앞에, 도중, 그리고 후에 취합니다. 샘플링 간격은 관심 있는 뇌 영역, 분석 중인 신경 전달 물질, 분석물의 투석 농도 및 사용된 분석 화학 장비의 민감도에 따라 달라집니다. 조미료와 GABA 샘플링을 위한 해마에서 여기에서 행해진 수집 단계는 다음과 같습니다:
   1. 기준선: 실험 시작 시, 투석 샘플을 60분 동안 10분 간격으로 수집합니다.
   2. 뇌진탕 후 또는 부끄러운 부상: 뇌진탕 이나 가짜 부상 후, 추가 90 분 (9 샘플)에 대 한 샘플을 수집.
6. 1 μL의 0.25 mol/L 과염소산으로 미리 로드된 분수 바이알에서 각 투석기 시료를 수집하여 분해를 방지합니다. 후속 분석을 위해 샘플을 4°C에 저장합니다.
7. 마지막 투석기 샘플의 수집에 따라, 나트륨 이소플루란을 전달하는 코 콘으로 쥐를 다시 마취 (2.5%) 0.5 L /min 산소 흐름에서.
8. 캐뉼라에서 미세 투석 프로브를 제거하고 obturator를 다시 삽입 한 다음 쥐를 동물 보호 시설로 되돌리시고 되돌리.

4. 뇌진탕 장치 설치

1. 절차가 시작되기 전에, 450g의 질량을 얻기 위해 단단한 황동에서 뇌진탕 (직경 19mm)을 가하는 데 사용되는 무게를 개척하십시오. 수직 폴리 염화 비닐 (PVC) 가이드 튜브 내부 1.0m의 거리에서 예비 구멍을 드릴.
2. 날카로운 면도날로 알루미늄 시트를 슬릿. 슬롯 알루미늄 시트는 황동 무게에서 머리 충격 후 몸의 가속을 방해하지 않고 쥐 (295 ~ 351g)의 무게를 지원해야합니다.
3. 슬롯형 플렉시글라스 프레임(길이 38cm x 너비 27cm x 깊이 30cm, 도 3A,B)에폼 쿠션(길이 37cm x 너비 26cm x 깊이 12cm)을 단단히 테이프로 넣습니다.
4. 플렉시글라스 프레임을 PVC 가이드 튜브 아래에 배치합니다(직경 20mm x 길이 1.5m).
5. 슬롯 알루미늄 위에 3.5 cm 의 클램프 스탠드가있는 PVC 가이드 튜브를 제자리에 잡습니다.
6. 나일론 플라이 낚시 줄 (용량 9.1 kg, 0.46 mm 직경)을 금속 루프를 통해 부착하여 무게의 바닥이 슬롯 알루미늄 위에 2.5 cm 매달려 있어 쥐가 거품 쿠션에 떨어질 때 여러 번 부딪히는 것을 방지합니다.
7. 나일론 플라이 낚시 줄을 클램프 스탠드에 부착하십시오.
8. 나일론 플라이 낚시 줄로 PVC 튜브를 통해 무게를 끌어 올려 1.0 m에 예비 드릴 구멍을 통해 육수 키를 삽입하여 제자리에 유지하십시오.

5. 뇌진탕 유도

1. 투석 샘플 수집의 기준상 단계 후, 발가락 핀치에 대한 반응이 없을 때까지 이소플루란 나트륨(0.5 L/min 산소 흐름에서 2.5% 이소플루란)을 전달하는 코 콘을 배치하여 쥐를 가볍게 마취시한다(섹션 3.1에서 언급한 바와 같이).
2. 동물이 슬롯형 알루미늄 시트에 놓아 머리가 황동 무게의 경로에 직접 배치되도록하십시오(그림 3C,D). 체중이 발생하기 전에 쥐가 움직이거나 일어나지 않도록 코 콘으로 마취를 유지하십시오.
3. 코 콘을 제거하고 육신 키를 당깁니다. 무게는 PVC 관을 통해 수직으로 떨어지고 쥐의 머리에 영향을 미칩니다. 쥐는 급속한 180 ° 회전을 겪고뒷면에 착륙합니다 (그림 3E).
4. 거품 쿠션에서 쥐를 제거하고 케이지에 뒷면에 놓습니다.
5. 디지털 타이머를 사용하여 회복 및 부상 심각도의 표시로 올바른 반사 시간을 측정합니다. 올바른 반사 시간은 설치류가 깨어나고 자발적으로 척추 위치에서 경향이있는 위치로 자신을 깨우거나 걷기 시작할 때까지 충격에서 총 시간입니다. 사망, 골절 또는 출혈의 징후를 기록하십시오.
   참고: 절차는 반복된 뇌진탕에 대한 다른 시점에서 동일한 주제에 반복 될 수있다.

6. 샴 유도

1. 투석 샘플 수집의 기준기 단계 후, 나트륨 이소플루란을 전달하는 코 콘을 배치하여 쥐를 가볍게 마취 (2.5%) 발가락 핀치에 대한 반응이 없을 때까지 0.5 L / 분 산소 흐름 (섹션 3.1에서 언급 한 바와 같이).
2. 동물이 슬롯형 알루미늄 시트에 놓아 머리가 황동 무게의 경로에 직접 놓이게 합니다. 쥐가 움직이거나 일어나지 않도록 코 콘으로 마취를 유지하십시오.
3. 코 콘을 제거하고 육수 키를 당기지 않고 알루미늄 시트에서 동물을 제거합니다. 쥐는 빠른 180 ° 회전을 겪지 않을 것입니다.
4. 쥐를 케이지에 등뒤로 놓습니다.
5. 디지털 타이머를 사용하여 신경학적 복원의 지표로 올바른 시간을 측정합니다.

7. 고성능 액체 크로마토그래피

1. 신속한 분리 형광 검출을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 사전 열 유도체화, 신속한 분리 자동 샘플러 및 펌프 결합으로 구성된 시스템으로 신경 전달 물질 수준(즉, 글루타메이트 및 GABA)을 결정합니다. 3.0 x 50mm 5 μm 분석 컬럼에 있습니다.
2. 100 mmol/L 나트륨 인산염 디베이직 (Na₂HPO_4),3.5 % 아세토니트릴 및 20 % 메탄올로 이월단계를 준비하십시오. 인산으로 pH를 6.7로 조정 (85%) 필요에 따라.
3. 유량을 0.5mL/min으로 설정합니다.
4. 재고 솔루션에서 신선한 일일 파생시약 및 작업 표준(100ng/mL)을 준비합니다. 시료를 사용하여 냉장(10°C) 급속 분리 자동 샘플러에 적재하십시오.
5. H₂O와 20 μL의 o-phthaldehyde (0.0143 mol/L)로 희석된 3-메르카포피온산(0.071 mol/L)의 20 μL로 분석 컬럼에 각 분획을 순차적으로 섞고 0.1 mol/L 나트륨 테트라보레이트로 희석합니다. 혼합물이 반응할 수 있도록 10분 동안 두는다.
6. 다음 시료의 오염을 방지하기 위해 각 주입 후 주사 루프를 메탄올(20%)으로 플러시합니다.
   참고: 글루타메이트 보존 시간은 이 프로토콜에서 약 1분, 각 샘플에 대해 총 30분의 실행 시간입니다.
7. 크로마토그래피 피크를 분석하는 동안 알려진 표준의 보존 시간에 따라 일치하는 샘플을 사용하여 알려지지 않은 피크를 식별합니다. μg/mL로 타랄리산의 수준을 표현합니다.

8. 학비학

1. 미세 투석 절차와 뇌진탕 또는 가짜 부상 유도 후 한 달, 케타민 (70 mg/kg)과 자일라진 (10 mg/kg)의 칵테일을 주입하여 동물을 마취시키고 상각 알수데히드 (4%)로 안락사시킵니다. 및 식염수 심장 내 관류.
2. 설치류를 참수 한 다음 뇌를 해부.
3. 뇌를 파라포름알데히드에 저장 (4%) 그리고 그 후 자당의 용액 (30 %)에서 냉동 보호.
4. 저온 저온 으로 50 μm의 관상 섹션에서 뇌를 슬라이스.
5. 부상 및 프로브 배치 (Nissl 염색)의 조직학적 검증을 위해 크레실 바이올렛으로 뇌 조각을 염색하십시오.

결과

생체 내 뇌성 분당해와 힘과 회전을 결합하는 뇌진탕 모델을 사용하여, 급성 세포 외 글루타메이트 및 GABA 변화는 뇌진탕 또는 가짜 부상에 따라 시간이 지남에 따라 21 남성, 성인, 스프라그 -Dawley 쥐에서 조사되었다 해마의 CA1 부위에 가이드 캐뉼라를 이식하십시오.

프로브 배치 및 부상의 조직학적 검증
크레실 바이올렛으로 염색 된 섹션에 해마 조직 손상의 조직 학적 검증 에 따라 대규모 내뇌 출혈 이나 타박상과 같은 형태학적 변화가보고되지 않았습니다. 가이드 캐뉼라 이식 및 미세 투석 프로브 삽입은 부상과 가짜 케이스 사이의 사소하고 유사한 손상을 유도. 더욱이, 가짜 상해 또는 뇌진탕 유도 직전에 프로브를 제거하지 않은 것은 현미경(도2B,C, 각각)에서 볼 수 있듯이, 프로브의 막이 여전히 손상되지 않은 것과 같이 구별할 수 있는 해마 조직 손상을 산출하지 않았다. 그 후 (그림2D,E). 파라포름알데히드와 함께 주입된 뇌진탕 및 가짜 부상 뇌 (4%) 1 개월 후 미세 투석 절차는 육안으로 구별 할 수 없습니다 (그림2F,G).

반사 시간 권리
부상당한 그룹에서 동물은 샴 케이스 (학생의 t 테스트, p = 0.042801)에 비해평균 적정 시간이 크게 증가했다 (그림 4) 의식을 회복시 기절 나타났다. 뇌진탕 그룹에서 10 의 경우, 단일 동물은 체중 감소 다음 충격 부위에서 출혈의 사소한 징후를 보였다. 두개골 골절이나 두개내 출혈의 다른 징후는 관찰되지 않았습니다.

생체 내 뇌성 미세 확장해
우리의 방법의 대표적인 결과로 작용하기 위하여는, 투석물의 15μL 견본은 해마에서 추출되었습니다, 생체 내에서, 10 분 간격으로 1 μL/min. 조미료와 GABA의 세포외 수준은 기준선 도중 6개의 견본에서 측정되었습니다 ( 60 분) 및 9 개 샘플에서 가짜 부상 또는 뇌진탕유도 (90 분).

글루타민산염의 세포 외 농도
외상 유도 후 처음 10분 동안 해마의 CA1 영역에서 세포외 글루타메이트 농도의 현저한 증가가 관찰되었고, 외상유도 후 10분 동안은sham 상해에 비해 (Mann-Whitney U Test, p = 0.009175) (그림 5). 글루타메이트 농도의 다른 차이는 다른 시점에서 그룹 간에 관찰되지 않았다.

세포 외 세포 농도 GABA
GABA 농도에 유의 한 변화 는 샴 부상에 비해 외상의 유도 후 처음 10 분 동안 해 마의 CA1 영역에서 관찰 되었다 (Mann-Whitney U 테스트, p = 0.943861)(그림6). 뇌진탕 케이스와 가짜 부상 케이스 사이의 다른 시점에서 GABA 농도에 다른 중요 한 차이가 없었다.

그림 1: 연구 프로토콜의 개략적 개요. 이 수치는 IO Masse 2018에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 프로브 배치 및 부상의 조직학적 검증. (A) Paxinos 및 Watson의 스테레오탁시크 아틀라스를 사용하여 해마에서 미세 투석 프로브 및 가이드 캐뉼라 배치 부위의 코로나 뷰. (B) 해마 조직 손상(cresyl violet)의 대표적인 광현미경 그래프는 부적물 손상 케이스로부터 미세투석 프로브 및 가이드 캐뉼라에 의해 생성된다. (C) 뇌진탕 케이스로부터 미세투석 프로브 및 가이드 캐뉼라에 의해 생성된 해마 조직 손상(cresyl violet)의 대표적인 광현미경 그래프. (D) 뇌진탕 유도 전에 미세 투석 프로브의 대표적인 광현미경 사진. (E) 뇌진탕 유도 후 미세 투석 프로브의 대표적인 광현미경 촬영. 멤브레인은 여전히 손상되지 않습니다. (F-G)를입력합니다. sham (F) 및 뇌진탕 (G)의 대표적인 현미경 사진은 가짜 부상 또는 뇌진탕 절차 후 1 개월에 4 % 파라 포름 알데히드와 관류 다음 뇌를 손상. 육안으로 검사하면 2 개의 뇌는 구별 할 수 없습니다. 이 수치는 IO Masse 2018에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 뇌진탕 장치 및 미세 투석 계측기 필수 구성 요소 묘사. (A) 래트 스테이지 위에 위치한 낙하 중량을 위한 수직 폴리염화비닐(PVC) 가이드 튜브, 플렉시글라스 프레임, 폼 쿠션, 컴퓨터 제어 미세 주입 펌프, 가스밀폐 주사기, 액체로 구성된 전체 조립의 사진 스위블, 나란히 융합실리카 입구 출구 라인. (B) 모든 관련 치수와 플렉시 글라스 프레임과 폼 쿠션의 회로도 표현. (C) 폼 쿠션 위의 래트 스테이지 역할을 하는 알루미늄 호일의 슬롯 조각 사진. (D) 떨어지는 무게에 의한 머리 충격 직전에 무대에서 쥐의 위치를 보여주는 사진. (E) 머리 충격 후 쥐를 보여주는 사진으로, 머리에 충격을 받은 후 쥐의 몸체의 180° 수평 회전을 보여주고 가속 및 회전을 계속한다. 이 수치는 IO Masse 2018에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 적절한 시간. 쥐가 마취로부터 깨어나 서서 걸리기 쉬운 위치로 뒤집거나 뇌진탕(빨간 다이아몬드, n=10) 또는 sham 상해(파란색 사각형, n= 11)를 따라 걷기 시작하는 시간의 히스토그램 표현. 뇌진탕 그룹에서 쥐는 가짜 부상 그룹에 비해 오른쪽에 훨씬 더 오래 걸렸다. 평균 값은 각 그래프에서 가로선으로 표시됩니다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p & 0.001. 이 수치는 IO Masse 2018에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 글루타민산염의 세포 외 농도. 기준선(60분) 및 뇌진탕(레드 다이아몬드, n=10) 또는 샴 손상 후(파란색 사각형, n = 11) 조건(90분) 동안 해마에서 미세 투석으로 측정된 글루타민산염(μg/mL)의 평균 세포외 농도. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 이 수치는 IO Masse 2018에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: GABA의 세포 외 농도. 기준선 (60 분) 및 뇌진탕 후 (레드 다이아몬드, n = 10) 또는 sham 상해 (파란색 사각형, n = 11) 조건 (90 분) 동안 해마에서 미세 투석에 의해 측정 된 GABA (μg / mL)의 평균 세포 외 농도. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 이 수치는 IO Masse 2018에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜의 중요한 단계
신뢰할 수 있는 결과를 생성하려면 이 프로토콜의 중요한 단계에 특별한 주의가 필요합니다. 캐뉼라 이식 수술 중, 특히 충격 부위에 유출되는 것을 방지하기 위해 매우 액체인 경우 필요 이상으로 시멘트를 사용하지 마십시오. 이식 부위를 막지 않으려면 캐뉼라와 길이가 같은 직강포를 사용하십시오. 미세 투석 절차 동안, 캐뉼라에 천천히 프로브를 삽입하고 투석기 샘플링을 위해 완전히 삽입되어 있는지 확인하십시오. 뇌진탕 유도 전에 알루미늄 시트가 날카로운 면도날로 제대로 슬롯되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 황동 무게의 충격은 알루미늄 시트를 찢는 것으로 충분하지 않으며 쥐는 180 ° 회전을 겪고 등뒤로 착륙하는 대신 가슴을 아래로 유지합니다. 이 경우, 유도 된 부상은 무딘 충격으로 인해 발생하며, 열린 두개골 체중 감소 모델에서 볼 수있는 것과 는 달리 훨씬 더 심각합니다. 뇌진탕 유도 하는 동안, 이 쥐의 두개골에 중요 한 손상을 생성 할 것 이다 무게와 캐뉼라에 영향을 하지 마십시오. 실험 중에 조작 오류를 제한하기 위해 2팀으로 팀을 구성하는 것이 좋습니다.

수정 및 문제 해결
미세 투석 절차 동안, 흐름은 일정해야하고 프로브가 펌프에 연결되면 관류 속도에 적합한 볼륨을 산출한다. 부피가 낮을수록 프로브의 멤브레인에 막힘이 있거나 라인의 기포가 막히는 것을 나타낼 수 있습니다. 막히는 경우 프로브를 폐기하고 교체해야 합니다. 그러나 라인에서 ACSF를 순환시켜 기포를 배출할 수 있습니다. 막힘이나 기포가 없고 여전히 흐름이 없는 경우, 끝에 가장 가까운 유출 튜브의 작은 부분을 절단할 수 있습니다.

방법의 제한 사항
웨인 주립 대학 체중 감소를 사용하여 다른 연구는 몇 가지 기본적인 구조 및 분자 변화를 평가했다¹⁸. 그러나 보다 광범위한 조사는 이 절차의 정당성을 유지할 것입니다. 후성 유전학 및 세포 수준에서 일어나는 생물학적 및 신경 해부학적 변화에 관한 정보는 우리의 방법의 신뢰할 수 있고 번역 가치를 더욱 공고히 할 것입니다. 더욱이, 인지 기능의 평가는 설치류 모델(33)에서mTBI와 관련된 결과의 신뢰할 수 있는 척도이다. 이 프로토콜에서 시간 대 오른쪽을 측정 하 고 sham 케이스에 비해 부상 된 경우에 크게 지연 된 동안, 미래의 연구 는 설치류에 외상 유도 다음 인지 기능을 측정 에 집중 해야.

기존 /대체 방법에 대한 방법의 중요성.
이 방법의 주요 의미는 두 가지입니다 : 첫째, 그것은 웨인 주립 대학 절차와 뇌진탕의 성공적인 유도를 허용, 이는 머리와 몸통의 빠른 가속과 감속을 할 수 있습니다. 이 방법으로 심호흡 정지, 두개골 골절, 높은 사망률 및 충격 부위에서 눈에 보이는 대뇌 타박상의 징후와 같은 심각한 부상 결과를 피할 수있었습니다. 둘째, 이러한 미세투석 기술은 외상 유도^14,16에 이어 처음 10분 이내에 일어나는 급성 및 단명한 세포간 글루타메이트 방출을 이전에 입증한 성공적으로 복제했다. 더욱이, 전체 절차에 걸쳐 삽입된 프로브를 유지하면 반복되는 미세 투석 프로브 삽입(34)에 연결된 mTBI 에민감한 혈액-뇌 장벽에 손상을 유도할 가능성이 현저히 감소한다.

메서드의 향후 응용 프로그램 또는 방향.
웨인 주립 대학 체중 투하 절차의 사용하기 쉬운 측면과 미세 투석에 의해 측정 된 급성 세포 외 신경 전달 물질 수준 변화를 감안할 때, 미세 투석과 뇌진탕을 결합한 우리의 쥐 모델은 신뢰할 수있는 연구원을 제공합니다 인간의 두개골 외상의 생체 역학을 충실하게 재현하고 뇌진탕의 분자 효과를 세로로 특성화하는 도구. 우리의 쥐 모델은 또한 동물을 희생할 필요 없이, 생체 내 약리학 에이전트의 기계장치 그리고 효험을 공부하는 귀중한 기회를 제안하기 때문에 치료 연구의 다양한에서 사용될 수 있었습니다. 더욱이, 여기에 제시된 것과 같은 쥐 모형의 가용성은 크게 신경 전달 물질 불균형 과 뇌진탕의 행동 결과 사이 관계의 더 나은 이해를 촉진할 수 있었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Microdialysis Guide 캐뉼라 이식 수술
케타민 염산염(100mg/ml)	바이오니케	1989529
자일라진 염산염(100mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
클로르헥시딘 글루코네이트 2% 및 이소프로필 알코올 2% 용액	Carefusion	260100C
리도카인 염산염	Alveda Pharma	0122AG01
부피바카인 하이드로클로라이드	Hospira	1559
안과 연고	Baussh and Lomb inc.
입체 액자	스톨팅	51600
입체 캐뉼라 홀더 암	하버드 장치	72-4837
드릴	Dremel	8050-N/18
봉합사 코팅 Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
치과 아크릴 시멘트	하버드 장치	72-6906
나사	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
미세 투석 절차
CMA 402 주사기 펌프	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
마이크로 주사기 2.5ml 유리	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
저토크 듀얼 채널 석영 라이닝 스위블	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC 주철 지지 링 스탠드	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy 조절 가능한 각도 클램프	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 중탄산나트륨	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	인공 뇌척수액(aCSF)
용 MgCl2 염화마그네슘	Sigma-Aldrich 캐나다	M8266-100G	인공 뇌척수액(aCSF)
NaCl 염화나트륨	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	인공 뇌척수액(aCSF)용
L-아스코르브산	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	인공 뇌척수액(aCSF)
KCl 염화칼	Sigma-Aldrich 캐나다	P9333-500G	인공 뇌척수액(aCSF)용
NaH2PO4 인산나트륨 일염기성	시그마-알드리치 캐나다	S0751-1KG	인공 뇌척수액(aCSF)용
CaCl2 염화칼슘	시그마-알드리치 캐나다	383147-100G	인공 뇌척수액(aCSF)
라이터	캐나다 타이어		실험실 건설 프로브용 / 대부분의 철물점에서 구매 가능
에폭시 접착제	캐나다 타이어		실험실에서 제작된 프로브용 / 대부분의 철물점에서 사용 가능한
슈퍼 글루 젤	캐나다 타이어		실험실에서 제작된 프로브용 / 대부분의 철물점에서 사용 가능한
열 수축 튜브 0.063" 내경 가드너 벤더	캐나다 타이어		실험실에서 제작된 프로브용 / 대부분의 철물점에서 사용 가능한
컷오프 휠 Dremel #409	캐나다 타이어		실험실 건설 프로브 / 대부분의 철물점에서 사용 가능
BD Needle 26 게이지 0.5 인치 PrecisionGlide 멸균	305111 Fisher Scientifique	14-826-15	실험실 건설 프로브
BD Needle 21 게이지 1.5 인치 PrecisionGlide 멸균 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	실험실 건설 프로브
26G 스테인레스 스틸 튜빙 1 피트	HRS Scientific	SST-26 / FT	실험실 구성 프로브
용 폴리에틸렌 튜빙 PE / 20 .024 "OD X .015"ID	HRS Scientific	C315CT	실험실 구성 프로브
용 폴리에틸렌 튜빙 PE / 10 .024 "OD X .011"ID	HRS Scientific	C314CT	실험실 구성 프로브
용 폴리에틸렌 튜빙 PE / 50 .038 "OD X .023"ID	HRS Scientific	C313CT	실험실에서 제작한 프로브용
30S WIRE ST. 세인트 0.008X 1' Long	HRS Scientific	008BSH/30S	실험실용 건설 프로브
Polymicro Technologies 유연한 용융 실리카 모세관 튜빙 내경 50µ m, 외경 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	실험실 구성 프로브
스펙트럼 132294 마이크로 투석 중공사 멤브레인 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	실험실 구성 프로브
스테인레스 스틸 칼라	Sirnay In.c	304	실험실 구성 프로브 / Custome made
Name	회사	카탈로그 번호	코멘트
뇌 기구
Brass 무게	Rapido Mé 주식회사 탈		기본
금속 루프	Rona Inc.		대부분의 철물점에서 사용 가능
PVC 가이드 튜브	Rona Inc.		대부분의 철물점에서 사용 가능한
Alluminum Foil	Alcan		대부분의 식료품점에서 사용 가능한
테이프			상업적으로 사용 가능
GSC 주철 지지 링 스탠드	Fisher Scientifique	S13748
U-Shaped Plexiglas Frame	Pré sentoirs 플렉시 플러스 Inc.		맞춤형
폼 쿠션	무스 D & R 폼 Inc.		맞춤형
면도날	VWR International	55411-055
초강력 Trilene XT 20 lb. Berkley	캐나다 타이어		대부분의 철물점에서 사용 가능
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Stop Watch			대부분의 스포츠 용품 소매점
에서 사용 가능Animal Preparation
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Name	Company<	strong>카탈로그 번호	코멘트
미세 투석 가이드 캐뉼라 이식 수술
케타민 염산염 (100 mg/ml)	바이오니케	1989529
자일라진 염산염 (100 mg/ml)	비메다	8XYL004C
클로르헥시딘 글루코네이트 2% 및 이소프로필 알코올 2% 용액	케어퓨전	260100C
리도카인 염산염	Alveda Pharma	0122AG01
부피바카인 염산염	Hospira	1559
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입체 액자	스톨팅	51600
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Cannula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
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미세 투석 절차
CMA 402 주사기 펌프	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
마이크로 주사기 2.5ml 유리	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
저토크 듀얼 채널 석영 라이닝 스위블	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC 주철 지지 링 스탠드	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy 조절 가능한 각도 클램프	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 중탄산나트륨	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	인공 뇌척수액(aCSF)
용 MgCl2 염화마그네슘	Sigma-Aldrich 캐나다	M8266-100G	인공 뇌척수액(aCSF)
NaCl 염화나트륨	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	인공 뇌척수액(aCSF)용
L-아스코르브산	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	인공 뇌척수액(aCSF)
KCl 염화칼	Sigma-Aldrich 캐나다	P9333-500G	인공 뇌척수액(aCSF)용
NaH2PO4 인산나트륨 일염기성	시그마-알드리치 캐나다	S0751-1KG	인공 뇌척수액(aCSF)용
CaCl2 염화칼슘	시그마-알드리치 캐나다	383147-100G	인공 뇌척수액(aCSF)
라이터	캐나다 타이어		실험실 건설 프로브용 / 대부분의 철물점에서 구매 가능
에폭시 접착제	캐나다 타이어		실험실에서 제작된 프로브용 / 대부분의 철물점에서 사용 가능한
슈퍼 글루 젤	캐나다 타이어		실험실에서 제작된 프로브용 / 대부분의 철물점에서 사용 가능한
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컷오프 휠 Dremel #409	캐나다 타이어		실험실 건설 프로브 / 대부분의 철물점에서 사용 가능
BD Needle 26 게이지 0.5 인치 PrecisionGlide 멸균	305111 Fisher Scientifique	14-826-15	실험실 건설 프로브
BD Needle 21 게이지 1.5 인치 PrecisionGlide 멸균 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	실험실 건설 프로브
26G 스테인레스 스틸 튜빙 1 피트	HRS Scientific	SST-26 / FT	실험실 구성 프로브
용 폴리에틸렌 튜빙 PE / 20 .024 "OD X .015"ID	HRS Scientific	C315CT	실험실 구성 프로브
용 폴리에틸렌 튜빙 PE / 10 .024 "OD X .011"ID	HRS Scientific	C314CT	실험실 구성 프로브
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30S WIRE ST. 세인트 0.008X 1' Long	HRS Scientific	008BSH/30S	실험실용 건설 프로브
Polymicro Technologies 유연한 용융 실리카 모세관 튜빙 내경 50µ m, 외경 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	실험실 구성 프로브
스펙트럼 132294 마이크로 투석 중공사 멤브레인 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	실험실 구성 프로브
스테인레스 스틸 칼라	Sirnay In.c	304	실험실 구성 프로브 / Custome made
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뇌 기구
Brass 무게	Rapido Mé 주식회사 탈		기본
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면도날	VWR International	55411-055
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