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방법 논문

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

11.4K 조회수

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DOI:

10.3791/59624

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2019년 5월 25일

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1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

요약

우리는 RNA 정화와 결합된 리보솜에 있는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 EC 특정 유전 꼬리표를 통해 마우스 두뇌, 폐 및 심혼 조직에서 직접 혈관 내피 세포 (Ec)에서 리보솜 결합mRNA를 정화하는 접근을 제시합니다 .

초록

많은 연구는 qPCR 및 RNA 염기서열 분석에 의한 전사체 및 유전자 발현의 시험관 내 분석을 위해 동물로부터 시험관 내 세포 분석 및 전체 조직 또는 특정 세포 유형을 분리하는 것으로 제한되었습니다. 복잡한 조직 및 기관에 있는 특정 세포 모형의 포괄적인 전사체 그리고 유전자 발현 분석은 유전자가 통제되는 세포와 분자 기계장치를 이해하고 조직 항상성 및 기관과의 그들의 협회를 이해하는 것이 중요합니다 함수. 이 기사에서는, 우리는 예를 들어 동물 폐의 혈관 내피에서 생체 내에서 직접 리보솜 결합 RNA의 격리를위한 방법론을 보여줍니다. 조직 처리 및 RNA 정제를 위한 특정 물질 및 절차는 동맥 생성 유전자 검정을 위한 RNA 질 및 수율의 평가 뿐만 아니라 실시간 qPCR를 포함하여 기술될 것이다. 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술로 알려진 이 접근법은 복잡한 조직에서 임의의 특정 유형에서 생체 내에서 직접 특정 세포 유형의 유전자 발현 및 전사체 분석의 특성화에 활용될 수 있다.

서론

포유류 뇌, 심장 및 폐와 같은 복잡한 조직에서는 높은 수준의 세포 이질성이 전체 조직 샘플에서 파생된 유전자 발현 데이터의 분석을 복잡하게 만듭니다. 생체 내에서 특정 세포 유형에서 유전자 발현 프로파일을 관찰하기 위해, 새로운 방법론이 최근에 개발되었으며, 이는 임의의 유전자 정의 세포 유형의 전체 번역 된 mRNA 보체의 심문을 허용한다. 이 방법론은 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술1,2. 그것은 동물에 있는 그밖 혈관신생 관련 유전자를 유전으로 조작과 결합될 때 내피 세포 생물학 및 혈관 신생을 공부하는 유용한 공구입니다.

혈관신생 PKD-1 신호및 혈관신생 유전자 CD36의 전사가 내피세포(EC) 분화 및 기능성 혈관신생3,4,5,6에중요하다는 것을 보여주었다. 유전자 전사 및 EC 분화에서 혈관 신생 및 대사 신호의 분자 메커니즘을 결정하기 위해 TRAP 기술 1을 기반으로 특별히 삭제 된 혈관 신생 유전자를 사용하여 유전자 조작 TRAP 마우스를 만들었습니다1 , 2. 또한, 우리의 TRAP 동물에서, 뿐만 아니라 그들은 혈관 내피 또는 cd36 유전자의 글로벌 삭제에 pkd-1 또는 cd36 유전자 결핍을 가지고 있지만, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)도 유전적으로 태그 EC의 번역 리보솜. TRAP은 표적 조직의 혈관 내피에서 직접 리보솜 결합 mRNA의 친화도 정제를 허용하여 유전자 발현 및 EC 분화와 관련된 새로운 전사체의 식별을 가능하게 하며, 생체 내 조건 하에서 직접 혈관 신생. 우리는 성공적으로 이 유전으로 조작된 동물에 있는 내피에서 리보솜 바인딩된 RNA를 격리했습니다. 정제된 RNA는 EC 분화 및 기능의 조절에서 혈관신생 또는 동맥신생 유전자의 추가 특성화에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 생체 내에서 직접 ECs에서 mRNA의 격리를 위한 TRAP 접근법을 구현하는 단계별 가이드를 제공한다.

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프로토콜

동물 실험을 위해, 여기에 기술된 모든 방법은 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 시약 준비

  1. 용해 완충액을 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2,0.5 mM DTT, 100 mg/mL 사이클로헤오히미드, 프로테아제 억제제 및 재조합 RNase 억제제의 농도로 준비한다.
    1. 다음 시약을 RNase 없는 탈이온수 500 mL에 추가: HEPES 1.19 g, 5.59 g의 KCl, MgCl2,DTT 35 mg, 사이클록색시미드 0.5 mL, NaOH 는 pH 7.4까지 필요, EDTA 무프로테아제 억제제(10mL당 1개의 미니 정제) 및 RNase 억제제(1개 0 μL/mL).
    2. 4°C 냉장고에 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  2. 10 mM HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl 2,1 % vol / vol CA-630, 0.5 mM DTT 및 100 mg / mL 사이클로헴 세척 완충제를 준비하십시오.
    1. RNase-free 탈이온수 의 500 mL에 다음 시약을 추가: HEPES의 1.19 g, KCl의 13.05 g, MgCl의 0.24g, 5 nonionic의 5 mL, 비 치성 세제, 5 의 7.7 DTT의 mg 튜브, 그리고 0.5 cyclohexie의 0.5 mL까지.
    2. 4°C 냉장고에 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  3. 실험을 시작하기 전에 항 GFP 항체를 단백질 G 자기 구슬에 결합합니다.
    1. 단백질 G 구슬에 PBS 200 mL에 희석 된 항 GFP 항체 10 mg을 추가하십시오.
    2. 실온에서 10 분 동안 끝 끝 회전으로 인큐베이팅하십시오.
    3. 비드를 마그네틱 랙에 놓고 상급을 제거합니다.
    4. 200 mL의 PBS에 구슬을 일시 중단하고 최대 1 주 동안 4 ° C 냉장고에 보관하십시오.
  4. 100 mg/mL 사이클로헵시미드로 차가운 PBS를 준비하세요.
    1. 99개의 얼음 차가운 PBS에 1부의 사이클로착시미드 용액(100 mg/mL)을 추가합니다.

2. 원하는 조직을 분리하고 라이즈합니다.

  1. 케타민 (500 mg / kg / 체중)과 자일라진 (10 mg / kg / 체중)의 IP 주입으로 마우스를 안락사시키고 원하는 조직 (즉, 심장, 폐)을 분리하십시오. 즉시 다음 단계로 진행합니다.
  2. 원하는 조직을 100 mg/mL 사이클로헵시미드와 함께 얼음으로 차가운 PBS 500 mL에 넣습니다.
  3. 모터 구동 균질화 또는 작은 클리어런스 유리 균질화로 세포 현탁액으로 조직을 다진. 모터 구동 균질화를 사용하는 경우, RNA 변성 방지를 위해 저주파수(<15,000 Hz)에서 균질화를 1분 미만으로 제한하십시오.
  4. 파이펫팅하고 버퍼를 여러 번 다시 그려 서 200 mL의 lysis 버퍼에서 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 또한 스몰 클리어런스 유리 균질화로 10스트로크 또는 모터 구동 균질화기에서 저주파(&15,000Hz)에서 15초 동안 셀 서스펜션을 균질화합니다.
  5. 원심분리기는 4°C에서 2,000 x g에서 10분 동안 균질화하여 펠릿 핵 및 큰 세포 파편을 하고, 상류를 유지한다.
  6. 1% vol/vol 및 DHPC에 1% vol/vol및 DHPC에 30 mM에 비변성, 비변성 세제를 상급에 추가합니다. 얼음에 5분 동안 배양합니다.
  7. 원심분리기는 펠릿 불용성 물질에 16,000 x g에서 10 분 동안 용해됩니다. 향후 단계에 대한 입력으로 명확한 용해의 15 %를 전송하고 유지합니다.

3. 리보솜/mRNA 복합체 분리

  1. 50 mL의 항체 결합 구슬을 세포 용해 상류에 넣고 4 °C에서 혼합물을 배양하고 30 분 동안 끝 부분 회전을 합니다. 이것은 반대로 GFP 항체가 GFP 태그된 리보솜을 묶을 것입니다, 우리가 이 리보솜에서 RNA를 더 격리하는 것을 허용하는 곳에 입니다.
  2. 마그네틱 랙에 구슬을 모으고 고염 폴리섬 세척 버퍼로 5회 세척하십시오.
    1. 구슬이 튜브 의 측면에 수집되면 액체를 그려 폐기합니다. 그런 다음 파이펫을 다시 그리고 200 mL의 고염 폴리섬 세척 버퍼를 여러 번 다시 그립니다. 이 단계를 5번 반복하고 마지막 반복 후 모든 버퍼를 모두 버립니다. 즉시 다음 단계로 진행합니다.

4. mRNA 분리

  1. RLT 버퍼에 구슬을 배치합니다. 다음 단계는 RNeasy 미니 키트 프로토콜에서 직접 수행되며 어떤 방식으로든 확장되지 않았습니다.
    주의: RLT 버퍼에는 구아니딘 염이 포함되어 있습니다. 표백제와 섞지 마십시오.
  2. 원심분리기는 최고 속도 13,000 rpm 또는 4 °C에서 16,000 g에서 3 분 동안 용해됩니다. 파이펫팅을 하여 350 mL의 상류를 조심스럽게 제거하고 새로운 마이크로 퍼지 튜브로 옮김을 옮김. 후속 단계에서이 상급 (용해)만 사용하십시오.
  3. 마이크로 퍼지 튜브에 70% 에탄올의 동일한 부피를 추가합니다.
  4. 형성되었을 수 있는 침전을 포함하여 샘플의 최대 700 mL을 2 mL 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 이송합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 15초 동안 15초 동안 15초 동안 1,000 x g의 원심분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 세척합니다. 흐름을 취소합니다.
  5. 스핀 열에 350mL의 버퍼 RW1을 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 15초 동안 15초 동안 15초 동안 1,000 x g의 원심분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 세척합니다. 흐름 스루를 버리고 다음 단계에서 수집 튜브를 다시 사용합니다.
    주의: 버퍼 RW1에는 구아니딘 염이 포함되어 있습니다. 표백제와 섞지 마십시오.
  6. 스핀 열에 350mL의 버퍼 RW1을 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 ≥8,000 x g에서 15초 동안 원심분리기를 닫습니다. 흐름을 취소합니다.
  7. 스핀 열에 버퍼 RPE 500mL를 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 15초 동안 15초 동안 15초 동안 1,000 x g의 원심분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 세척합니다. 흐름을 취소합니다.
  8. 스핀 열에 버퍼 RPE 500mL를 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 ≥8,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 사용하여 스핀 컬럼 멤브레인을 씻으십시오. 그런 다음 수집 튜브에서 스핀 컬럼을 조심스럽게 제거하여 컬럼이 흐름 통과에 접촉하지 않도록합니다.
  9. 스핀 컬럼을 새 2mL 컬렉션 튜브에 놓고 흐름 통과가 있는 이전 튜브를 폐기합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 원심분리기를 최고 속도로 1분간 닫아 잔류 완충장치를 제거합니다.
  10. 스핀 컬럼을 새 1.5mL 컬렉션 튜브에 배치합니다. 30-50 mL의 RNase-free 물을 스핀 컬럼 멤브레인에 직접 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 RNA를 용해시키기 위해 ≥8,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 하십시오.
  11. 예상 RNA 수율이 >30 mg인 경우, RNase가 없는 다른 30-50 mL의 물과 함께 4.10 단계를 반복하거나 4.10 단계 (높은 [RNA]가 필요한 경우)에서 용적물을 사용하십시오. 4.10 단계에서 수집 튜브를 재사용하십시오.
  12. RNA 시퀀싱 또는 실시간 정량적 PCR을 포함한 다운스트림 분석을 위해 정제된 RNA를 사용하거나RNase-free H2 O에 용해된 RNA를 최대 1년간 -80°C에서 저장합니다.

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결과

우리의 이전연구 4,7은 CD36이 LPA/PKD-1 신호 통로를 통해 동맥 분화 및 모세관 동맥화를 위한 스위치로 작동할 수 있다는 것을 건의합니다. LPA/PKD-1-CD36 신호 축이 생체 내 동맥 발생에 필수적인지 여부를 연구하기 위해, 우리는 글로벌 cd36 결핍 또는 내피 특이적 cd36- 또는 pkd-1 결핍뿐만 아니라 선택적 격리를 허용하는 새로운 TRAP 라인을 설립했습니다. GFP에 의한 크레마크 세포 계에서 리보솜 결합 RNA의, 및 cre 활성화형광 리포터2로 유용하다.

유전형 검사를 수행함으로써, 우리는 cd36 유전자가 내피 특이적 cd36 null 마우스에 대한 전 세계적으로 또는 혈관 내피에서 삭제된 것을 관찰하고(데이터는 도시되지 않음), pkd-1 유전자는 또한 혈관 내피에서 삭제되었다. 도 1은 생성...

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토론

혈관신생은 복잡한 다단계 과정으로, EC 특이적 혈관신생 유전자 전사 및 발현이 EC 분화 및 혈관신생 재프로그래밍에 필수적인 역할을 하는3,4. 생체 내 분자 수준에서 포유류 혈관 시스템의 기능을 더 잘 이해하기 위한 세포 다양성 및 건축 적 복잡성의 장벽을 극복하기 위해 EC 특이적 CD36과 함께 EC 특이적 TRAP 마우스를 만들었습니다. , EC 특이적 pkd-1 결핍 또는 글로벌 cd36 결핍은 다른 유전자 조작 마우스 라인과 조합하여 Pu 실험실2에서 생성된 다용도 플록스 TRAP 마우스 모델 또는 EGFP-TRAP을 사용하여 결핍을 한다. 이것은 cd36 유전자 발현8에 있는 EC 특정 또는 글로벌 결핍에 의하여 생체 내 온전한 조직에서 혈관 EC의 전체 번역된 mRNA 보체의 검사를 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

렌 박사의 작품은 미국 심장 협회 (13SDG14800019)에 의해 지원됩니다. BR), 앤스 호프 재단 (FP00011709; BR), 미국 암 학회 (86-004-26; MCW 암 센터 BR), 그리고 건강의 국립 연구소 (HL136423; BR); 조던 파머는 2018 MCW CTSI 500 스타 인턴십 프로그램에 의해 지원됩니다. P. 모란은 NHLBI (5T35 HL072483-34)의 기관 연구 교육 보조금에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2100 나노칩과 피코칩을 사용한 전기영동 바이오분석기AgilentG2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapersSarstedt83.1832
HomogenizersFisher ScientificK8855100020
Magnet (Dynamag-2)Invitrogen123-21D정제 스케일에 따라 다릅니다. 1.5-mL 튜브의 시료는 다음에 농축될 수 있습니다. DynaMag-2
미니 원심분리기Fisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C 분광 광도계Thermo Scientific ND-2000C
냉장 원심분리기Eppendorf5430R1.5-mL 마이크로 원심분리기 튜브용 로터
RNase-free 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브Applied Biosystems 
Rnase-free 50-mL 코니컬 튜브Applied Biosystems 
RNase-free 1000-μ l 필터 팁RaininRT-1000F
RNase-free 200-μ l 필터 팁Rainin RT-200F
RNase-free 20-μ l 필터 팁Rainin RT-20F
호모게나이저용 로터Yamato LT-400D
튜브 로테이터, Labquake 브랜드써모 피셔13-687-12Q
AM12450AM12501

참고문헌

  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

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재인쇄 및 허가

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