방법 논문

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

DOI:

10.3791/59624

⸱

2019년 5월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

요약

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우리는 RNA 정화와 결합된 리보솜에 있는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 EC 특정 유전 꼬리표를 통해 마우스 두뇌, 폐 및 심혼 조직에서 직접 혈관 내피 세포 (Ec)에서 리보솜 결합mRNA를 정화하는 접근을 제시합니다 .

초록

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많은 연구는 qPCR 및 RNA 염기서열 분석에 의한 전사체 및 유전자 발현의 시험관 내 분석을 위해 동물로부터 시험관 내 세포 분석 및 전체 조직 또는 특정 세포 유형을 분리하는 것으로 제한되었습니다. 복잡한 조직 및 기관에 있는 특정 세포 모형의 포괄적인 전사체 그리고 유전자 발현 분석은 유전자가 통제되는 세포와 분자 기계장치를 이해하고 조직 항상성 및 기관과의 그들의 협회를 이해하는 것이 중요합니다 함수. 이 기사에서는, 우리는 예를 들어 동물 폐의 혈관 내피에서 생체 내에서 직접 리보솜 결합 RNA의 격리를위한 방법론을 보여줍니다. 조직 처리 및 RNA 정제를 위한 특정 물질 및 절차는 동맥 생성 유전자 검정을 위한 RNA 질 및 수율의 평가 뿐만 아니라 실시간 qPCR를 포함하여 기술될 것이다. 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술로 알려진 이 접근법은 복잡한 조직에서 임의의 특정 유형에서 생체 내에서 직접 특정 세포 유형의 유전자 발현 및 전사체 분석의 특성화에 활용될 수 있다.

서론

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포유류 뇌, 심장 및 폐와 같은 복잡한 조직에서는 높은 수준의 세포 이질성이 전체 조직 샘플에서 파생된 유전자 발현 데이터의 분석을 복잡하게 만듭니다. 생체 내에서 특정 세포 유형에서 유전자 발현 프로파일을 관찰하기 위해, 새로운 방법론이 최근에 개발되었으며, 이는 임의의 유전자 정의 세포 유형의 전체 번역 된 mRNA 보체의 심문을 허용한다. 이 방법론은 리보솜 친화도 정제(TRAP) 기술1,2. 그것은 동물에 있는 그밖 혈관신생 관련 유전자를 유전으로 조작과 결합될 때 내피 세포 생물학 및 혈관 신생을 공부하는 유용한 공구입니다.

혈관신생 PKD-1 신호및 혈관신생 유전자 CD36의 전사가 내피세포(EC) 분화 및 기능성 혈관신생3,4,5,6에중요하다는 것을 보여주었다. 유전자 전사 및 EC 분화에서 혈관 신생 및 대사 신호의 분자 메커니즘을 결정하기 위해 TRAP 기술 1을 기반으로 특별히 삭제 된 혈관 신....

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프로토콜

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동물 실험을 위해, 여기에 기술된 모든 방법은 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 시약 준비

  1. 용해 완충액을 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2,0.5 mM DTT, 100 mg/mL 사이클로헤오히미드, 프로테아제 억제제 및 재조합 RNase 억제제의 농도로 준비한다.
    1. 다음 시약을 RNase 없는 탈이온수 500 mL에 추가: HEPES 1.19 g, 5.59 g의 KCl, MgCl2,DTT 35 mg, 사이클록색시미드 0.5 mL, NaOH 는 pH 7.4까지 필요, EDTA 무프로테아제 억제제(10mL당 1개의 미니 정제) 및 RNase 억제제(1개 0 μL/mL).
    2. 4°C 냉장고에 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  2. 10 mM HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl 2,1 % vol / vol CA-630, 0.5 mM DTT 및 100 mg / mL 사이클로헴 세척 완충제를 준비하십시오.
    1. RNase-free 탈이온수 의 500 mL에 다음 시약을 추가: HEPES....

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결과

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우리의 이전연구 4,7은 CD36이 LPA/PKD-1 신호 통로를 통해 동맥 분화 및 모세관 동맥화를 위한 스위치로 작동할 수 있다는 것을 건의합니다. LPA/PKD-1-CD36 신호 축이 생체 내 동맥 발생에 필수적인지 여부를 연구하기 위해, 우리는 글로벌 cd36 결핍 또는 내피 특이적 cd36- 또는 pkd-1 결핍뿐만 아니라 선택적 격리를 허용하는 새로운 TRAP 라인을 설립했습니다. GFP에 의한 크레마크 세포 계에서 리보솜 결합 RNA의, 및 cre 활성화형광 리포터2로 유용하다.

유전형 검사를 수행함으로써, 우리는 cd36 유전자가 내피 특이적 cd36 null 마우스에 대한 전 세계적으로 또는 혈관 내피에서 삭제된 것을 관찰하고(데이터는 도시되지 않음), pkd-1 유전자는 또한 혈관 내피에서 삭제되었다. 도 1은 생성.......

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토론

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혈관신생은 복잡한 다단계 과정으로, EC 특이적 혈관신생 유전자 전사 및 발현이 EC 분화 및 혈관신생 재프로그래밍에 필수적인 역할을 하는3,4. 생체 내 분자 수준에서 포유류 혈관 시스템의 기능을 더 잘 이해하기 위한 세포 다양성 및 건축 적 복잡성의 장벽을 극복하기 위해 EC 특이적 CD36과 함께 EC 특이적 TRAP 마우스를 만들었습니다. , EC 특이적 pkd-1 결핍 또는 글로벌 cd36 결핍은 다른 유전자 조작 마우스 라인과 조합하여 Pu 실험실2에서 생성된 다용도 플록스 TRAP 마우스 모델 또는 EGFP-TRAP을 사용하여 결핍을 한다. 이것은 cd36 유전자 발현8에 있는 EC 특정 또는 글로벌 결핍에 의하여 생체 내 온전한 조직에서 혈관 EC의 전체 번역된 mRNA 보체의 검사를 .......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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렌 박사의 작품은 미국 심장 협회 (13SDG14800019)에 의해 지원됩니다. BR), 앤스 호프 재단 (FP00011709; BR), 미국 암 학회 (86-004-26; MCW 암 센터 BR), 그리고 건강의 국립 연구소 (HL136423; BR); 조던 파머는 2018 MCW CTSI 500 스타 인턴십 프로그램에 의해 지원됩니다. P. 모란은 NHLBI (5T35 HL072483-34)의 기관 연구 교육 보조금에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2100 나노칩과 피코칩을 사용한 전기영동 바이오분석기AgilentG2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapersSarstedt83.1832
HomogenizersFisher ScientificK8855100020
Magnet (Dynamag-2)Invitrogen123-21D정제 스케일에 따라 다릅니다. 1.5-mL 튜브의 시료는 다음에 농축될 수 있습니다. DynaMag-2
미니 원심분리기Fisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C 분광 광도계Thermo Scientific ND-2000C
냉장 원심분리기Eppendorf5430R1.5-mL 마이크로 원심분리기 튜브용 로터
RNase-free 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브Applied Biosystems 
Rnase-free 50-mL 코니컬 튜브Applied Biosystems 
RNase-free 1000-μ l 필터 팁RaininRT-1000F
RNase-free 200-μ l 필터 팁Rainin RT-200F
RNase-free 20-μ l 필터 팁Rainin RT-20F
호모게나이저용 로터Yamato LT-400D
튜브 로테이터, Labquake 브랜드써모 피셔13-687-12Q
AM12450AM12501

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al.

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재인쇄 및 허가

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태그

RNATRAPRNAGFPGFPRNAqPCR

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