배반포 생검 및 유리화는 착상 전 유전자 검사를 효율적으로 수행하기 위해 필요합니다. 조나 펠루시다의 순차적 개방및 5-7일째에 7-8개의 트로페토더세포를 회수하는 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 이하의 환경 조건으로 제한한다.
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이 논문에서
요약
초록
Blastocyst 생검은 착상 전 유전 시험을 가진 IVF 주기 도중 믿을 수 있는 유전 진단을 얻기 위하여 실행됩니다. 그런 다음, 이상적인 워크플로우에는 진단 기술의 처리 시간으로 인해 안전하고 효율적인 유리화 프로토콜이 수반되고, 선택된 배아를 다음과 같은 자연 주기에서 생리적 자궁 내막상으로 이송한다. 조나 펠루시다의 순차적 개방과 5-10 개의 영양 토내 세포 (이상적으로 7-8)의 검색을 포괄하는 생검 접근법은 필요한 조작 횟수와 배아의 노출을 최적 환경 조건에 모두 제한합니다. 적절한 훈련 후, 이 기술은 생검의 타이밍 (~8 분, 접시 당 생검에 대한 배아의 수에 따라 3-22 분 범위), 최종 진단을 얻은 (~ 97.5 %)에 걸쳐 다른 운영자에 걸쳐 재현 가능했다 그리고 생생한 출산율은 유혈모세포 전이(>40%)입니다. 생검, 유리화 및 온난화 후 생존율은 99.8%로 높았다. 온난화에서 1.5 h에서 재 팽창 속도 는 97%로 높았다, 주로 생검과 유리화 사이의 타이밍에 의존 (이상적으로 ≤30 분), 배반 세포 형태학적 품질과 생검의 날. 일반적으로 붕괴 된 배반포를 vitrify하는 것이 좋습니다. 따라서, 비 PGT 주기에서, 레이저 지원 인공 수축 은 동결 보존 전에 배아 붕괴를 유도하기 위해 수행 될 수있다. 가장 유망한 미래 관점은 배아 DNA의 가증한 근원으로서 배반포 배양 후 IVF 배양 배지의 비침습적 분석이다. 그러나 이 잠재적아방가르드는 아직 조사 중이며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 정의하고 검증해야 합니다.
서론
현대 인간 발생학의 주요 목표는 자극된 주기 당 출생 수를 최대화하고 임신을 달성하기 위하여 비용, 시간 및 노력을 감소시키는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위하여는, 태아 선택을 위한 검증된 접근은 IVF 주기 도중 장악된 코호트 내의 생식 유능한 태아를 확인하기 위하여 이용되어야 합니다. 최신 증거에 따르면, blastocyst 배양 1은 포괄적인 염색체 검사 및 유리화 온난화 된 유엽태아 전달 (ET)과 결합되어 IVF 효율을 높이는 가장 효율적인 프레임 워크2이다. 분명히, 이수성 검사는 현재 주로 trophectoderm (TE)에서 검색 된 몇 가지 세포에서 표현되는 배아 표본을 필요로, 즉, 임신 중 배아 부속서 (예를 들어, 태반)에 기원을 제공하는 배반포의 섹션 . karyotype 분석을 넘어, 또한 단 하나 유전자 돌연변이는 착상 전 유전 시험으로 알려져 있는 임상 전략의 한 부분으로 TE 생검에서 평가될 수 있습니다 (PGT; -A 는 이수화에 대한, 구조 염색체 재배열을 위한 -SR, 단조로운 질병을 위한 -M). 그밖 난모세포/배아 생검 방법은 지난 십년간, 즉 극성 바디 생검 및 blastomere 생검을 통해 임상으로 이론화되고 채택되었습니다. 그러나, 그들의 사용은 그들의 절차....
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프로토콜
인간 배반세포 생검을 위한 프로토콜은, 여기에서 기술한, G.EN.E.R.A. 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
참고: 필요한 재료는 재료 표를 참조하십시오. 추가 필요한 재료는 실험실 신발과 의상, 수술 안면 마스크, 헤어 커버, 수술 장갑, 영구 무독성 마커, 집게 및 소독제를 수반한다. 외과 용 가운, 일회용 수술 장갑, 안면 마스크, 헤어 커버의 사용은 오염의 위험을 방지하기 위해 필수적입니다. 모든 작업 영역과 공정에 관련된 장비는 모든 절차를 시작하기 전에 실험실 소독제(예: Oosafe)로 철저히 세척해야 합니다. 사용되는 모든 소모품과 매체는 멸균되고 개별적으로 포장되거나 aliquoted되어야 합니다. 생검 및 튜브에 전용 워크스테이션을 사용하고 절차에 관련된 운영자 (배아 학자 및 증인)에게만 해당 영역의 액세스를 제한하는 것이 좋습니다.
1. 생검 절차 전날준비
-
생검 문화 후 접시를 준비합니다.
- 20 μL IVF 배양 배지6 방울을 IVF 배양 접시에 놓고 배아 배양용 프리웜 미네랄 오일 6 mL로 오버레이(....
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결과
도 6은 프로토콜을 표준화하고 각 작업자의 성능을 모니터링하기 위해 채택될 수 있는 생검 절차의 모든 결과의 체계를 나타낸다. 주요 절차 결과는 생검 / 생검을 완료하는 타이밍입니다; 주요 기술적 인 결과는 결정적 이거나 결정적인 진단을 초래할 수있는 유전자 검사 후 생성 된 플롯의 품질이며, 후자는 진단되지 않은 배반포의 재생검을 필요로합니다. 주요 생물학적 결과는 온난화 후 저온 생존 및 재팽창 대 변성의 속도; 마지막으로, 주요 임상 결과는 유리화 된 배반포 전달 후 의 출생 률입니다. 3개의 이전 연구 결과에서는 기술, 생물학 및 임상 결과를 위한 중앙에 정의된 KPI를보고했습니다 11,13,16. 여기서는 생검 시기에 대한 KPI가 어떻게 정의.......
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토론
훈련 기간을 마친 숙련된 숙련된 배아학자만이 TE 생검과 배반포 유리화를 모두 수행해야 합니다. 또한, 생검 접시에서 생검 된 배반포의 움직임을 시술 을 모니터링하고 효율적인 추적성을 보장하기 위해 증인이 필요합니다 (보충그림1) 생검 후 접시에 (보충그림 1) ), 다음 유리화 판(보충 도1) 및 마지막으로 유리화 지지체 (보조도1); ii) 생검접시로부터 PCR관으로 의생TE세포의이송(보충체도1); iii) 온난화 및 전사 단계 사후 진단. 모든 감시 단계에 대한 자세한 설명은 이전에 게시된 실패 모드 및 효과 분석(FMEA)을 참조하십시오14.
이 백서에 설명된 모든 방법은 현지 규정(이탈리아 법 40/2004)을 존중합니다. 법에 따르면, 사실, 부부는 IVF 주기 동안 생산 된 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
AG와 RM은 데이터를 수집하고 원고를 작성했습니다. DC는 데이터를 분석하고, 대표 결과를 작성하고, 통계를 수행하고, 원고를 수정했습니다. FMU와 LR은 결과와 전체 원고에 대한 비판적 인 토론을 제공했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet 조절 가능한 핸들 세트 | Cook | G18674 | 스트리퍼 홀더 |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF 전자 증인 시스템 | CooperSurgical Fertility & 게놈 솔루션 | RI Witness ART 관리 시스템 | |
| 도립 현미경 | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| 층류 후드 | IVF TECH | 등급 A 공기 흐름 | |
| 레이저 대물 | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| PCR 튜브용 미니 원심분리기 | Eppendorf | CSLQSPIN | 0.2 mLl PCR 튜브용 |
| 실체현미경 | Leica | Leica M80 | |
| 온도 조절기 | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| 트라이 가스 인큐베이터 | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30 µ m ID, 플랫 35 ° C |
| Cryolock Cryolock | CL-R-CT | ||
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | 가 보충된 IVF 배양 배지 |
| Cook | G17934 | ||
| Flexipet 피펫 | Cook | G26712 | 140µ m 스트리핑 피펫 팁 |
| Flexipet 피펫 | Cook | G46020 | 300µ m 피펫 팁 |
| 고정 피펫 | RI | 7-71-IH35/20 | 30 µ m ID, 플랫 35 ° C |
| 인간 혈청 알부민 | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF 배 | Falcon | 353653 | |
| 미네랄 오일 | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher Scientific | 176740 | IVF dish 4- 슬라이딩 뚜껑이 있는 웰 플레이트 |
| Primaria 세포 배양 접시 | Corning | 353802 | 60 mm x15 mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| 혈청학 피펫 | Falcon | 357551 | 10ml |
| 멸균 일회용 Gilson 팁 | Eppendorf | 0030 075.021 | 200 µ L |
| 유전자 실험실 | PCR 튜브(0.2mL)에서 제공하는 튜빙 키트, 로딩 용액, 생검 세척 용액 | ||
| 유리화 매체 | Kitazato | VT801 | 평형 및 유리화 용액 |
| 온난화 매체 | Kitazato | VT802 | 해동 및 희석 용액 |
참고문헌
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118(2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A.
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재인쇄 및 허가
