세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
경쟁 지수는 세균적 적합성 및/또는 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 접근법의 유용성은 수행하기 쉽고 야생 형 유기체에 많은 균주의 적합성을 표준화하는 능력에 의해 예시됩니다. 이 기술은 그러나, 유효한 자형표 마커 및 동시에 평가될 수 있는 긴장의 수에 의해, 복제 실험의 큰 숫자에 대한 필요를 만드는 제한됩니다. 많은 수의 실험과 동시에, 자형표 마커에 기초한 박테리아를 정량화하기 위한 인건비 및 재료 비용은 중요하지 않다. 긍정적인 양상을 유지하면서 이러한 부정적인 측면을 극복하기 위해, 우리는 세균 염색체에 유전 마커를 엔지니어링 한 후 미생물을 직접 정량화하는 분자 기반 접근법을 개발했습니다. 독특한, 25 염기 쌍 DNA 바코드는 살모넬라의야생 형 및 돌연변이 균주의 염색체에 무해한 궤적에 삽입되었다. 시험관내 경쟁 실험은 풀링된 균주로 구성된 이노큘라를 사용하여 수행하였다. 경쟁 후, 각 스트레인의 절대 숫자는 디지털 PCR을 사용하여 정량화하고 각 변형에 대한 경쟁 지수는 그 값에서 계산되었다. 우리의 데이터는 살모넬라정량화에 대한 이 접근법이 매우 풍부하고 정확하며, 매우 풍부하고(높은 체력) 및 희귀(낮은 피트니스) 미생물을 모두 검출하는 데 매우 민감하고 정확하며 정확하다는 것을 나타냅니다. 또한,이 기술은 미생물의 절대 정량화를 필요로하는 다양한 실험 설계뿐만 아니라 수정 할 수있는 염색체를 가진 거의 모든 유기체에 쉽게 적응 할 수 있습니다.
서론
병원성 유기체의 적합성 과 독성을 평가하는 것은 미생물학 연구의 근본적인 양상입니다. 그것은 균주 사이 또는 돌연변이된 유기체 사이 비교를 가능하게 합니다, 이는 연구원이 특정 조건의 밑에 특정 유전자의 중요성을 결정하는 것을 허용합니다. 전통적으로, 독성 평가는 다른 세균성 긴장을 사용하여 감염된 동물의 결과를 관찰하는 감염의 동물 모형을 이용합니다 (예를 들면 감염성 복용량50,치명적인 복용량50,죽음에 시간, 현상 엄격, 부족의 증상 등) 이 절차는 독성에 대한 귀중한 설명을 제공하지만 야생 형의 변화를 감지하기 위해 결과에 상당한 차이를 일으키기 위해 균주가 필요합니다. 더욱이, 결과는 질병 진행및 현상 엄격이 시간이 지남에 따라 주관적으로 정량화될 수 있기 때문에, 야생 형에 비교된 독성의 해석은 더 질적입니다 (즉, 더, 더 적게, 또는 동등하게 악성). 동물 감염 성 검사를 수행하는 일반적인 대안은 경쟁 지수 (CIs)를 생성하는 것입니다, 직접 혼합 감염에서 야생 형 대응에균주의 적합성 또는 독성을 비교값 1. 이 기술은 야생 형 균주에 독성을 표준화하고 감쇠정도를 반영하는 정량적 값을 결정함으로써 감염의 전통적인 동물 모델에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 취소된 경쟁....
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프로토콜
1. 고유 DNA 바코드를 플라스미드에 통합하여 전기 교환에 필요한 구성 요소를 포함
참고: 기존 pKD13 알릴릭 교환 플라스미드에 비해 카피 수가 높고 변환 효율이 향상된 pSKAP라는 새로운 플라스미드가 만들어졌습니다. 이는 단계 1.1-1.12(도1)에 기재되어 있다. 독특한 DNA 바코드와 알레르산화 를 위한 성분을 포함하는 최종 화된 플라스미드는 플라스미드 저장소(재료 표)를 통해 사용할 수 있습니다.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 pKD1314 및 pPCR 스크립트 캠 SK+를 루리아-베르타니 (LB) 국물에서 재배한 밤새 세균 배양물에서 50 μg/mL 카나마이신 또는 25 μg/mL 클로람페니콜(pKD13 및 pPCR 스크립트 캠용)으로 보충 SK+, 각각)(표 1).
- 제조 업체의 사양에 따라 상업적 제한 효소 힌드 III와 BamHI를 사용 하 여 두 플라스미드에 제한 소화를 수행 합니다.
- pPCR 스크립트캠 SK+반응에서 제한 효소 및....
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결과
이 방법론의 사용은 표적 DNA를 확인하기 위하여 이용된 각 탐사기의 감도 그리고 특이성을 확인하기 위하여 적당한 통제 반응이 수행된다는 것을 요구합니다. 이 대표적인 실험에서, 우리는 식별을 위해 8개의 해당 프로브로 8개의 고유 DNA 바코드를 검증했습니다. 모든 8개의 프로브는 NTC 및 음성 대조반응 모두에서 거짓양성의 낮은 비율을 가졌고(표 3), 매우 유사한 DNA 서열 들 사이에서도 그들의 특이성을 강조했다. 각 조건의 감도를 평가하기 위해, 독특한 바코드를 포함하는 gDNA는 7개의 나머지 바코드 서열 각각을 포함하는 gDNA의 일정한 배경에서 연속적으로 희석되었다. 위에서 설명한 접근법으로, 디지털 PCR은 거의 2,000,000개의 유사한 DNA 서열의 배경에있는 gDNA의 2 사본만큼 적게 구별할 수 있었습니다 (표 3).
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토론
미생물을 정확하게 정량화하는 능력은 미생물학 연구에 가장 중요하며, 초기 혼합 인구에서 독특한 균주를 열거하는 능력은 적합성 및 독성 특성을 평가하기위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다. 박테리아. 그러나, 이것을 달성하기 위한 기술은 분자 생물학에 있는 현대 발달과 보조를 맞추지 않았습니다. 이 기술은 S를 포함한 많은 박테리아의 염색체를 용이하게 수정할 수 있다. Typhimurium, 거의 2 년 동안 사용할 수 있다14,아직이 능력은 거의 독특한 DNA 서열분자 태깅 균주에 대 한 활용 되었습니다. 세균 염색체에 삽입된 독특하고 최소한의 파괴력의 DNA 바코드를 기반으로 쉽게 식별할 수 있는 균주를 생성할 수 있는 능력을 활용하여 이러한 분자 식별자를 감지하고 정량화하는 최첨단 기술과 결합하여 ( 즉, 디지털 PCR), 우리는 박테리아의 다양한 인구 내에서 쉽게 개별 균주를 정량화하기 위한 절묘한 감도, 특이성, 정확도 및 정밀도를 제공하는 시스템을 만들었습니다.<.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 간행물에 보고 된 연구는 조지 F. Haddix 대통령의 교수 연구 기금과 국립 보건원의 일반 의학 연구소에 의해 지원 되었다 (NIH) 수상 번호 GM103427. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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참고문헌
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- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F.
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