여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
동물 복지에 대한 전 세계적으로 증가하는 관심사는 제조업체와 국립 통제 연구소(OMCL)가 실험실 동물 실험의 교체, 감소 및 개선을 위한 3R 전략을 따르도록 장려하고 있습니다. 시험관 내 접근법의 개발은 광견병 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트의 대안으로 WHO 및 유럽 수준에서 권장됩니다. 광견병 바이러스 (RABV) 입자의 표면에서, 당단백질의 트리머는 바이러스 중화 항체 (VNAbs)를 유도하는 주요 면역 원을 구성한다. 중화 단일 클론 항체 (mAb-D1)는 당단백질의 트리메라 형태를 인식하는 ELISA 테스트는 백신 배치의 생산과 함께 네이티브 접힌 트리메릭 당단백질의 함량을 결정하기 위해 개발되었습니다. 이 시험관 내 효능 시험은 NIH 테스트와 양호한 일치를 입증했으며 RABV 백신 제조업체 및 OMcLs의 공동 시험에서 적합한 것으로 밝혀졌습니다. 동물 사용의 회피는 가까운 장래에 달성 가능한 목표입니다.
제시된 방법은 트리메릭 RABV 당단백질, 즉 면역원성 RABV 항원의 항원 부위 III(aa 330 to 338)를 인식하는 mAb-D1을 이용한 간접 ELISA 샌드위치 면역포지에 기초한다. mAb-D1은 백신 배치에 존재하는 당단백질 트리머의 코팅 및 검출 모두에 사용됩니다. 에피토프는 그것의 형태 특성 때문에 인식되기 때문에, 잠재적으로 변성된 당단백질 (더 적은 면역원성)은 mAb-D1에 의해 포착되고 검출될 수 없습니다. 시험되는 백신은 mAb-D1로 민감화된 플레이트에서 배양된다. 바운드 트리메릭 RABV 당단백질은 mAb-D1을 다시 첨가하여 확인되고, 과산화아제로 표지된 다음 기질 및 크로모겐의 존재에서 밝혀낸다. 시험된 백신 및 기준 백신에 대해 측정된 흡광도의 비교는 면역원성 당단백질 함량의 측정을 가능하게 한다.
서론
50년 이상 부터, NIH 시험1은 일괄 방출 전에 광견병 백신 효능을 평가하는 금 본위제 방법으로 사용된다. 이 시험은 광견병 바이러스 (RABV)의 도전 바이러스 표준 (CVS) 긴장으로 14 일 후에 시험될 백신을 가진 마우스의 군의 복강 내 면역으로 이루어져 있습니다. 효능은 IC 도전에서 살아남은 마우스의 비율에서 평가됩니다. WHO2 와 유럽 약전3은 여전히 백신 효능을 평가하기위한 NIH 테스트를 필요로하지만,이 테스트는 몇 가지 장애물을 겪습니다 : 결과는 매우 가변적4; 전염성 RABV는 도전 도중 사용되며 이것은 기술적 인 기술과 엄격한 생물 안전 조치를 모두 필요로합니다. 많은 수의 동물이 사용되고 있으며, 도전의 심각성은 심각한 윤리적 우려를제기5. 이 시험의 보다 적게 가혹한 변이는 개발되었습니다: 복막 내 면역 화 후에 2 주, 마우스는 IC에 의해 도전되지 않습니다 그러나 시험관외 중화 시험을 사용하여 그들의 혈청에 있는 특정 RABV 중화 항체 (VNAbs)의 존재를 위해 시험을 보았습니다. 그러나, 이 시험은 이미 수의학 백신
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 보안 예방 조치
참고: 이 방법은 살아있는 RABV 및 불활성화 백신 모두에 적용됩니다.
- 좋은 실험실 실습 및 안전 절차를 사용하십시오.
- 일회용 코트, 장갑, 마스크, 안경 등을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
- 살아있는 바이러스가 적정되면, 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛을 사용한다.
- 시료(시약, 세척용액 등)와 접촉하는 모든 물질을 전염성 물질로 고려하십시오.
- 오염 물질을 표백제 용액(하이포아염소산나트륨 2,5%)에 30분 간 침지하여 오염물질을 제거합니다.
- 우수 실험실 관행에 따라 화학 물질을 취급하십시오.
2. 준비
- 가능한 한 분석 등급 시약을 사용하십시오.
- 코팅 버퍼/탄산염 버퍼, 패시베이션 버퍼, 희석제 및 구연산염 완충액(표1)의신선한 용액을 준비하고 0.45 또는 0.22 μm 필터를 통해 필터를 사용하고 분석 순도를 보존하기 위해 사용 하기 전 하루 동안 4 °C에 보관하십시오.
- 시약이 사용 30분 전에 실온(+18°C ~ +25....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
다음 예에서 정제된 불활성화 광견병 바이러스 입자(PV 백신 균주)로 구성된 참조 백신 Lot 09가 사용된다. 이에 대한 당단백질 트리머(10 μg/mL) 함량은 총 바이러스 성 단백질(BCA 시험)의 측정 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 당단백질의 백분율의 평가 후에 확립되었다. 대안적으로, 교정된 기준 백신, 예를 들어, 광견병 백신에 대한 WHO6th 국제 표준(IS)(NIBSC 코드: 07/162)을 사용할 수 있다.
표 3은 전형적인 실험에 대한 OD 값(492 nm)을 나타낸다. 이러한 값을 사용하여, 기준 백신 곡선은 수직 축(선형 스케일)에 대한 기준 백신의 상이한 희석에서 평균 OD(공백의 평균 OD를 뺀)를 플로팅(1)하여 그려졌다; (2) 수평 축(로그계 척도)에서 당단백질 트리.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
mAb-D1에 의해 인식된 에피토프는 RabV 당단백질의 항원 부위 III에 위치하며 이는 VNAbs의 유도를 위한 면역 지배적일 뿐만 아니라 또한 신경성, 병원성40,,41 및 수용체인식에관여한다. 당단백질, 부위 II43을따라 또 다른 중요한 항원 부위가 있는데, 이에 대해 mAb-WI-111235와같은 여러 MAb가 분리되었다. 이들은 또한 실험의 유사한 모형에서 이용될 수 있습니다.
ELISA에 의한 이러한 시험관내 방법의 한 가지 제한은 시험될 광견병 바이러스 균주에 사용된 mAb에 의해 인식되는 에피토프의 필요한 보존에 상주한다. 지금까지, 인간 광견병 백신에 사용되는 모든 고전적인 긴장은 mAb-D1에 의해 인식됩니다. 동물 백신에 사용.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
실비 모르게오 박사와 장 미셸 채프살 박사는 백신 배치에 대한 ELISA 분석 결과를 확립하고 국제 워크샵 및 공동 연구를 조직하기 위해 주요 참여를 인정받아야 합니다. 우리는 원고의 비판적 독서사브리나 칼리에게 감사드립니다. 피에르 페린 박사는 mAb-D1의 격리와 특성화를 담당했습니다. 이 작품은 주로 인스티투트 파스퇴르 자금조달에 의해 지원되고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 클래스 II 생물 안전 캐비닛 | ThermoFisher Scientific | 10445753 | 살아있는 바이러스를 적정하는 경우 |
| 투명 평면 바닥 면역 비멸균 96-웰 플레이트, 400 &마이크로; L, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | 장전된 항체에 결합하는 데 좋습니다 |
| . Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric |
| Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 | Dutscher | 55303 | binding to the loaded antibody |
| Microplate Sealing 테이프(100 장) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate 단일 모드 리더 Sunrise | TECAN | ||
| Microplate 쉐이커-인큐베이터 | Dutscher | 441504 | |
| Microplate 세척기 Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| 멀티채널 피펫 (30-300 &마이크로; L) 12 | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| 싱글채널 피펫 (키트 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μ L 마이크로, 2-20 μ L, 20-200 μ L & 100-1000 &뮤; L) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |
참고문헌
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
