mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

Summary

우리는 메추라기 배아 모델 시스템에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현을 허용하는 방법으로 메신저 RNA (mRNA) 전기 를 보고합니다. 이 방법은 형광성 으로 세포를 표지하고 전기 개공 직후 시간 경과 현미경 검사법에 의해 생체 내 움직임을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

우리는 mRNA 전기 가기는 살아있는 메추라기 배아에 있는 세포에 DNA 전기 포공 보다는 더 빠르고 광범위하게 표지하기 위하여 형광성 단백질을 허용한다는 것을 보고합니다. 높은 형질감염 효율은 적어도 4개의 별개의 mRNAs가 ~87% 효율로 공동 형질감염되는 것을 허용합니다. 대부분의 전기 포어mAs는 처음 2시간 동안 전기 천공 후 저하되어 개발 배아에서 시간에 민감한 실험이 수행될 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 다양한 세포내 표적 형광 단백질을 인코딩하는 mRNAs로 전기화된 살아있는 배아를 동적으로 이미지화하는 방법을 설명합니다.

Introduction

전기 개출은 전기 펄스를 사용하여 플라즈마 막에 일시적인 기공을 생성하여 핵산이나 화학 물질과 같은 물질이 시토솔로 전달되도록하는 물리적 형질 감염 방법입니다. 전기 천공은 박테리아, 효모, 식물 및 포유류 세포^1,2,^3으로DNA를 전달하는 데 널리 사용됩니다. 그것은 일상적으로 세포의 개발 또는 라벨 이동 세포의 유전 제어를 연구하기 위해 개발 조류 배아 내에서 대상 세포와 조직에 유전 페이로드를 소개하는 데 사용^{4,5,6, 7}. 그러나 DNA 전기 화 8과 관련하여몇 가지 실험적 한계가 존재합니다. 예를 들면, DNA 전기천공은 수시로 세포 당 발현 벡터의 높게 가변적인 수를 소개하고 그 후에 mRNAs 및 단백질은 그(것)들이 인코딩합니다. 이러한 가변성은 이미지 분석과 데이터 해석을 모두 복잡하게 하는 상당한 세포 세포 이질성으로 이어질 수^있다9,^10. 추가적으로, DNA 전기 천공에서 단백질은 단지 발현하기 시작 ~3 시간 후 전기 천공및 12 시간까지 세포 수와 형광 강도의 최대 효율에 도달하지 않습니다, 가능성이 때문에 핵으로 전달하고 완료하는 데 필요한 시간 생체 내 전사 및 번역^{모두 11}.

대조적으로, mRNA 형질감염은 미세주입^12,13,mRNA lipofectamine 형질감염에 의한 인간 줄기세포를 재프로그래밍하여 제노푸스 라에비스 난모세포를 포함한 다양한 모델 시스템에서 효과적으로 사용되고 있다¹⁴ , 성인 마우스^15에서반응성 신경 줄기 세포를 전기화. 우리는 별개의 형광 성 단백질 (FPs)를 인코딩하는 시험관 내 합성 mRNAs를 사용하여 초기 조류 배아 발달 중에 세포를 효율적으로 라벨링하는 mRNA 전기 화기의 능력을 테스트했습니다. 우리의 연구를 위해, 우리는 pCS2+ 벡터, 제노푸스와 얼룩말 배아에서 단백질을 발현하기 위해 일반적으로 사용되는 다목적 발현 벡터를 사용했습니다. pCS2+에 있는 SP6 및 T7 RNA 중합효소 프로모터는 시험관 내 전사/번역 시스템에서 사용될 때 어떤 복제된 유전자든지에서 mRNA 그리고 단백질의 합성을 허용합니다.

여기에서, 우리는 mRNA 전기 천공이 메추라기 배아를 가두기에서 형광 성 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 보여줍니다. 우리는 이러한 연구에 사용되는 많은 발현 벡터를 설계하고 생성했습니다. 예를 들어, 우리는 LifeAct-eGFP 유전자^16을 CMV 프로모터 및 SP6 프로모터로부터 발현하기 위해 pCS2+ 벡터^17로 subcloned하였다. 삽입된 유전자는 SP6 프로모터의 하류및 SV40 폴리(A)꼬리(18)의 상류에 놓여 있다. mRNA 및 DNA와 함께 전기화된 배아에서, 시험관내 전사 mRNAs에서 부호매겨진 FPs는 전기 천공의 20 분 안에 처음 검출된 반면, DNA 발현 벡터에서 FPs는 3 시간 후에만 검출되었습니다. 막 단백질은 동시에 배아로 전기화될 수 있어 개별 세포에서 여러 단백질을 빠르고 효율적으로 발현할 수 있습니다. 마지막으로, 광표백(FRAP) 분석 후 생체 내 형광 회복을 사용하여, 우리는 대부분의 전기포케이트 mRNAs가 2시간 내에 붕괴되는 것을 보여준다. 따라서, 제한된 새로운 단백질 번역과 결합된 빠른 초기 단백질 생산은 mRNA 전기화를 발현의 시간적 조절이 필요할 때 귀중한 기술로 만든다.

Protocol

모든 동물 절차는 로스 앤젤레스 어린이 병원과 남부 캘리포니아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 생성 pCS2 기반 발현 벡터

1. pCS2.Lifeact-eGFP를 복제하려면, 2 μg의 pCS2.CycB1-GFP(다른 인서트를 포함하는 구조)를 BamHI(10 U)와 BsrGI(10 U)와 적절한 소화 완충제(재료 표 참조)로 소화하여 벡터 백본을 총 반응에서 1배로 희석하여 준비합니다. 37°C에서 1시간 동안 50 μL의 부피를 확인합니다(복제 절차의 회로도에 대한 그림 1 참조).
   1. 탈인염은 새우 알칼리성 인산파타제(1 U)를 첨가하여 제한 효소 반응으로부터 벡터 백본의 자유 3'OH 말단을 첨가한다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
   2. 전체 혼합물을 1% 아가로즈 젤/1x 트리스 아세테이트 EDTA(TAE) 버퍼에서 ~50분 동안 90V로 실행한 다음, 1x TAE 버퍼에서 에티듐 브로마이드의 0.5 μg/mL 용액으로 젤을 15분 동안 부드럽게 흔들어 주세요. 또한, DNA 크기를 결정하는 데 도움이 무료 차선에 분자량 마커를로드해야합니다.
   3. DNA 안전 UV Transilluminator를 사용하여 DNA 를 사용하여 DNA 를 사용하여 DNA를 니콜라는 것을 피하고, 아가로즈 겔에서 벡터 백본 (4kb의 예상 밴드 크기)을 신속하게 잘라내고 제조업체의 지침을 사용하여 젤 정제 키트를 사용하여 젤 조각에서 DNA 조각을 분리합니다.
2. 단계 1.1과 동시에, 37°C에서 1시간 동안 50 μL의 총 반응 량에서 1배로 희석된 적절한 소화 완충액에서 BglII(10 U) 및 BsrGI(10 U)로 2 μg의 pEGFP-N1-Lifeact를 소화하여 삽입을 준비한다. 1.1.2-1.3 단계에서 이전에 설명한 바와 같이 800 bp 대역을 분리하기 위해 전체 혼합물을 1% 아가로즈 겔로 실행한다.
3. 벡터와 삽입이 모두 분광광도계상에서 정제 및 정량화된 후, T4 DNA 리가제 버퍼에 벡터의 50 ng 및 삽입물의 38ng(삽입할 벡터의 1:3 몰 비)를 결합한 후 T4 DNA 리가제를 첨가하여 결찰 반응을 촉매한다. 또한, DNA 제어 없음, 벡터 전용 제어 및 삽입 전용 컨트롤을 설정합니다. 실온에서 모든 반응을 30 분 동안 배양하십시오.
   1. 결찰 혼합물의 1 μL을 유능한 대장균 DH10으로 변형시킵니다. 또한, 물만 음의 제어 및 pUC19 양성 제어의 20 pg를 변환합니다. 50 μg/mL 암피실린을 함유한 루리아 국물(LB) 한천 판에 박테리아를 펴고 37°C에서 밤새 배양합니다.
   2. 다음 날 아침, 각 접시에 식민지를 세는다.
      참고: 이상적으로는 음의 대조판에 콜로니가 없어야 하며, 벡터+삽입 결찰에 콜로니가 없고 벡터 전용 플레이트에 콜로니가 적어야 합니다.
   3. 벡터+삽입 결찰 혼합물로 변형된 한천 플레이트에서 적어도 8개의 세균 식민지를 선택하고 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 50 μg/mL Ampicillin을 함유한 액체 LB 국물 2mL로 접종합니다.
   4. 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 각 클론에서 DNA를 추출합니다.
   5. 37°C에서 1시간 동안 1회 희석된 적절한 소화 완충액에서 NotI(10 U) 및 BamHI(10 U)를 사용하여 각 클론으로부터 500 ng의 DNA를 사용하여 진단 제한 다이제스트를 실행하고 1x TAE 버퍼에서 1% 아가로즈 겔상에서 소화된 DNA를 실행한다. pCS2.Lifeact-eGFP 포지티브 클론의 예상 대역 크기는 3.9kb 및 978bp입니다.
   6. 양성 클론으로부터 의 DNA 의 1 pg-100 ng를 유능한 대장균 DH10으로 변환하고, 시험관 내 전사 반응(최소 10 μg)에 대한 충분한 양의 DNA를 얻기 위해 이전 단계에서 상세히 3-4miniprep 반응을 준비한다.

2. 체외 전사에 의한 mRNA의 준비

1. pCS2.LifeAct-eGFP 의 10 μg를 17°C에서 하룻밤 동안 50 μL의 총 반응 량에서 1x로 희석된 적절한 소화 완충액에서 NotI(10 U)로 인서트의 3' 끝에 선형화한다.
   참고: RNase 오염을 방지하고 mRNA 분해를 줄이려면 mRNA 샘플을 취급하는 동안 장갑을 착용하십시오.
2. 페놀의 혼합물을 사용하여 DNA를 정화 : 클로로 포름 : 이소아밀 알코올 (25 : 24 : 1, v / v).
   1. RNase 가 없는 물 150 μL을 첨가하여 소화 반응의 총 부피를 200 μL과 동일하게 만듭니다. 그런 다음 200 μL의 페놀을 추가하십시오 : 클로로 포름 : 이소아밀 알코올 및 20 s의 혼합물을 소용돌이.
   2. 최대 속도 (18,400 x g)의 마이크로 퍼지에서 2 분 동안 원심 분리기를 조심스럽게 선형화 된 DNA를 포함하는 상단 수성 상을 제거하십시오. 이 단계를 반복하여 추가 불순물을 제거하고 바닥과 상단 액체 상 사이에 형성 될 수있는 백색 침전물을 방해하지 않도록주의하십시오.
3. 1/10 부피 3M 나트륨 아세테이트 (RNase-free)와 100 % 에탄올의 2.5 부피를 추가하여 선형화 된 DNA를 침전시. 혼합물을 -20 °C에서 >30 분 동안 방치한 다음 최대 속도 (18,400 x g)로 원심 분리하여 DNA를 펠렛합니다.
   1. DNA 펠릿을 70% 에탄올로 씻은 다음 펠릿을 5분 동안 공기 건조시합니다.
   2. DNA 펠릿을 RNase 가 없는 물 5 μL에 녹입니다. 분광광도계로 DNA를 정량화합니다.
      참고: 예상 된 DNA 농도는 ~0.5-1 μg/μL A260/A280 비율 사이 1.7-2.0.
4. 생체외 전사(IVT)에 대해 선형화된 pCS2.LifeAct-eGFP DNA의 1 μg를 사용한다. 상용 키트(재료 표 참조)에서 제조업체의 지침에 따라 캡 아날로그(최종 농도 0.8mM) 및 NTP(ATP, CTP 및 TTP의 최종 농도 1mM, GTP의 경우 0.2mMM), 10x 반응 버퍼 2 μL(최종 농도)을 포함합니다. 1x), SP6 RNA 폴리머라제 2 μL, 최대 20 μL의 RNase 없는 물.
   1. 전사체 크기에 따라 IVT 혼합물을 약 2시간 이상 배양한다.
      참고 : 2 시간 배양은 3 kb 의 전사체에 적합하지만, 하룻밤 배양은 5 kb보다 큰 성적 증명서에 더 잘 작동합니다.
   2. 전사 반응에서 자유 뉴클레오티드를 제거하려면, 30 μL의 LiCl RNA 침전액(7.5 M 염화리산 리튬, 50 mM EDTA)을 첨가하여 mRNA를 침전시한다. 혼합물을 간략하게 -20°C에서 30분 간 보관합니다. mRNA를 최대 속도(18,400 x g)에서 마이크로퍼지에서 15분 동안 돌리고 70% 에탄올(RNase 불포함)으로 헹구습니다.
5. 합성된 mRNA를 RNase 가 없는 물 15 μL에 녹입니다. 합성 된 mRNA를 5 μL / 튜브 (총 3 튜브)에서 분배하고 장기 보관을위해 -80 °C에 놓습니다. 분광광도계로 mRNA를 정량화합니다.
   참고: 예상 수율은 mRNA의 15-20 μg입니다 (~1 μg / μL). 1 μL (1 μg / μL)은 mRNA가 1 μg / μL에서 500 ng / μL로 희석되고 각 배아가 ~ 200 nL로 주입된다는 가정하에 ~ 10 배아를 실험하기에 충분합니다. 따라서 각 튜브는 ~ 5 실험에 충분한 mRNA를 포함해야 합니다.
6. RNase 오염 제거 용액 (예를 들어, RNase Away)으로 모든 젤 장비를 청소 한 후 1 % 아가로즈 젤에서 1 % 아가로즈 젤에 ~ 300 ng를 실행하고 mRNA가 하나의 밴드로 나타나는지 확인하십시오 (이차 구조가 형성되면 다중 밴드가 존재할 수 있음) 및 얼룩이 없는 지 확인하십시오. RNA 분해를 나타내는 젤 레인에서 ppears.

3. mRNA 전기 화공 혼합의 준비

1. 원하는 농도에서 mRNA를 해동하고 희석하십시오 (RNase-free 물에서 250-500 ng /μL은이 작품에서 테스트 된 모든 mRNAs에 적합합니다). mRNA 주입 부위를 시각화하고 전극을 올바르게 배치할 수 있도록 1/10 량의 착색 염료(재료 표, RNAE-free, 0.1% 최종 농도 참조)를 추가합니다.
   참고: DNA와 RNA가 결합되어 공동 전기화를 수행하는 경우, mRNA 및 DNA 혼합물 이전에 페놀-클로로폼 추출 및 에탄올 침전을 사용하여 DNA가 RNases를 오염시키는 것이 없도록 하십시오.
   1. 모의(RNA 첨가 없음) 전기 증액을 사용하여 음의 대조군을 준비해야 한다. 가능하다면, 사전 검증된 mRNA(이전 실험에서 FP를 성공적으로 생성하는 것으로 나타난 mRNA)를 사용하여 양성 대조군을 준비한다.
      참고: 음성 대조는 데이터의 정규화를 위한 배경 형광 수준을 설치하기 위하여 모든 화상 진찰 실험을 위해 필수적입니다. 전기 개화 설정이 효과가 있는지 확인하도록 도와줌으로써 새로 전사된 mRNA로 작업할 때 긍정적인 제어가 특히 중요합니다.
2. mRNA 전기 포화 용액을 얼음 슬러리에 저장하여 전기 화를 진행할 준비가 될 때까지 열화를 방지하십시오.

4. 살아있는 메추라기 배아로 전기 포레이트 mRNAs

1. 갓 낳은 수정된 메추라기 알을 매일 모으고 1주일 이상 가습 냉장고에 13°C에 보관하십시오. 메추라기 알을 38°C에서 배양하여 원하는 배아 발달^{단계19,20,21까지}배양한다.
   참고: HH3 to HH5는 정적 및 동적 이미징 모두를 위한 본 연구에서 사용되었다. HH3 배아의 경우, 수확 전에 2시간 동안 실온에서 난자를 방치하면 배아가 냉각될 때 일반적으로 물리적 조작에 더 강하기 때문에 격리 과정이 훨씬 쉬워집니다.
2. EC 배양 시스템(22)에 따라배아를 분리및 준비한다. 음의 대조군(전기공화되지 않음)으로 작용하기 위해 적어도 하나를 포함하여 조건당 적어도 5개의 배아를 수집한다.
   1. 부드럽게 부수고 10cm 페트리 접시에 계란을 붓습니다. 전사 피펫으로 두꺼운 알부민의 대부분을 제거하고 배아가 종이 고리에 단단히 붙어 있는지 확인하기 위해 조직 닦아 노른자의 표면을 부드럽게 닦아 배아 주위에 남아있는 두꺼운 알부민을 제거합니다.
   2. 배아 위에 프리컷 필터 용지(재료 표참조)를 놓고 가위를 사용하여 배아 둘레를 부드럽게 자른다.
   3. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS로 배아의 근간을 하고, 부드러운 스트림을 사용하여 배아에 달라붙는 노른자를 비우게 합니다.
      참고: 이 단계는 이 태아가 노른자에 더 달라붙는 경향이 있고 수시로 후속 세척 단계 도중 vitelline 막에서 분리하기 때문에 더 젊은 (&HH3) 태아로 일할 때 중요합니다.
   4. 배아/종이 링을 비스듬히 위로 당기고 노른자를 빼내어 PBS로 채워진 페트리 접시에 넣고 추가 청소를 합니다. 노른자의 대부분이 제거되면, 한천 / 알부민의 반 고체 혼합물로 덮여 35mm 페트리 접시에 배아 복부 측면을 배치합니다.
3. 유리 마이크로파이펫 풀러 기기를 사용하여 6~8개의 10cm 길이의 유리 미세 모세관(O.D. = 1.2 mm)을 준비합니다.
4. 배아 복부 쪽을 PBS로 채워진 전기 화챔버에 올려 놓습니다. 유리 미세 모세관을 사용하여, 원하는 영역을 덮는 에피블라스트와 비텔린 막 사이의 공동에 mRNA 또는 DNA/mRNA 전기 화 혼합물의 200 nL의 볼러스를 주입한다.
   참고: 펠루시다와 오파카에 대한 일부 영역의 전체 전방 영역은 이 원고에 표시된 대부분의 실험에서 전기화되었다.
5. 다음 펄스 서열을 사용하여 배아의 상하와 전기포산에 각각 양극 및 음극(백금 평평한 사각형 전극, 측면 길이 5mm)을 놓습니다: 5V의 5제곱 전기 펄스, 100 ms 간격으로 50 ms 지속 시간 생체 내 전기 포더레이터를 사용하여. 전극 사이의 거리가 ~5mm인지 확인합니다.
   참고: 전기 개화 파라미터를 최적화하는 것은 깨지기 쉬운 배아 세포를 죽일 수있는 조건을 피하는 데 중요합니다. 전압, 펄스 길이, 펄스 간격 및 DNA 및 mRNA에 대한 펄스 수의 파라미터는 다양한 전기 천공 장치에 대해 고려되어야 합니다.
6. 38°C에서 전극배아를 원하는 발달 단계로 배양한다.
   참고: 형광 해부 입체 스코프 (재료 표참조)는 형질 감염 된 배아와 형질 감염되지 않은 배아를 선별하는 데 도움이됩니다.
7. 배아를 정적으로 이미지화할 경우, PBS에서 4% 파라포름알데히드에 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 고정시다.
   1. 가위로 여과지 둘레를 부드럽게 자르고 날카로운 집게로 등지 표면의 반짝이는 멤브레인을 벗겨 내어 비텔린 막에서 배아를 제거합니다.
   2. PBS/트리톤(0.1%)에서 고정 배아세척 2x 를 5분 동안 유지하고 원하시면 소자 혼성화 또는 면역 염색을 계속합니다.
   3. 마지막으로, PBS/트리톤에서 배아를 0.5 μg/μL DAPI로 염색합니다(0.1%). 실온에서 30분 이상. PBS/트리톤 2x에서 배아를 5분 동안 세척하고 SCALE-U2 용액^23에서 배아를 밤새 지웁습니다.
8. 전기 개루의 효율을 분석하려면(그림 2참조), ImageJ의 이진 및 입자 분석 도구 및 DAPI 채널을 사용하여 이미지의 모든 셀에서 핵 윤곽선을 얻습니다.
   1. ImageJ에서 바이너리 도구를 사용하려면 대부분의 셀을 포함하는 DAPI 채널에서 단일 z 슬라이스를 사용하고 Process > Binary > 바이너리만들기를 클릭합니다. 근처 셀을 분리하려면 프로세스 > 바이너리 > 유역.을클릭합니다. 입자 분석 및 크기가 100-500(μm 2)로 설정된 것을 클릭하여 셀 윤곽선을 가져옵니다.
   2. 대부분의 셀이 DAPI 채널에 윤곽이 있는지 확인하고 ROI 관리자 팝업 창에 더 > 저장을 클릭하여 셀 윤곽선을 저장합니다.
   3. 이러한 윤곽선을 사용하여 mRNA 또는 DNA 채널의 단일 z 슬라이스에서 이전에 저장된 파일을 열어 mRNA 및 DNA 채널에 대한 형광 강도 값을 얻은 다음 ROI 관리자에서 측정을 클릭합니다.
   4. 마지막으로, 이러한 강도 값을 필터링하여 형질감염되지 않은 세포와 형질감염시 6,000개의 형광 강도를 가진 세포와 6,000개의 형광 강도를 가진 세포를 계수합니다.

5. 전기 포어mAs에 의해 인코딩 된 이미지 FPs

1. 형광 해부 입체 에서 모든 전기 배아를 보고 동적 이미징 실험을 위한 가장 건강하고 최고의 전기 배아를 선택하십시오.
   1. 실험 중에 이 배아가 사망하는 경우에 대비하여 선택된 배아를 이미징하는 동안 별도의 배큐베이터에서 다른 전기배아 및 비전기배아(음성 대조군)를 계속 배양한다.
2. 동적 이미징의 경우, 앞에서 설명한 바와 같이 전체 마운트 ex ovo 조류 배아 배양을 사용하여^24,25,26 을 반전된 공초점 현미경으로 사용한다.
   참고 : 현미경은 이미징 중에 36 °C에서 온도를 유지하는 무대 인큐베이터 (재료 표참조)가 장착되어 있습니다. 36°C에서 배양된 배아가 더 높은 온도에서보다 더 오래 생존한다는 현미경 설정 동안, 아마도 레이저가 배아에 국소 가열을 일으킬 수 있기 때문에 관찰되었다. 독자는 자신의 현미경 설정을위한 최적의 무대 인큐베이션 온도를 결정해야합니다.
   1. 배아 발생을 동적으로 이미지화하고 시각화하기 위해, PBS에서 집게를 사용하여 배아를 이동시켜 배아의 등쪽쪽에 형성될 수 있는 기포를 제거하기 위해 PBS를 사용하여 전기 배아를 간략하게 청소합니다. 솔루션.
   2. 깨끗한 배아를 알부민 한천(~150 μL)의 얇은 층을 포함하는 이미징 접시에 직접 놓아 배아(22)의등쪽 표면에 기포가 발생하지 않도록 한다.
   3. 장기 이미징의 생존을 보장하기 위해 이미징 접시의 안쪽 가장자리에 작은 촉촉한 압연 티슈 페이퍼를 추가하고 파라핀 필름을 사용하여 접시를 밀봉하여 이미징 및 배양 중에 증발을 최소화합니다.
   4. 이 접시를 공초점 현미경의 예열 단계로 빠르게 이동하고 주입 및 전기 배기 영역을 식별하는 밝은 필드 채널 (PMT 레이저 20%)을 사용하여 배아에서 착색 된 염료를 찾습니다.
3. 이미징 소프트웨어를 원하는 목표(10 또는 20x), 이색 미러(GFP nm의 경우 488nm, RFP의 경우 561개), 방출 스펙트럼(GFP의 경우 499-562 nm, RFP의 경우 570-695nm)으로 설정하고 적절한 레이저(GFP의 경우 488nm, RFP의 경우 561nm)를 켭니다.
   참고: 전기포상 mRNA는 20분 이내에 나타난 단백질로 번역되었다(도 3참조). 이 논문에서 대부분의 이미지에 사용되는 이미징 메타데이터는 20배 의 객관적인 반전된 공초점 현미경이었습니다(재료 표참조) 픽셀 거주 시간, ~ 1.5 μs; 4줄 스캔의 평균.
   1. 이미징 소프트웨어에서 라이브를 클릭하고 각 현미경 레이저 전력에 따라 형광 강도에 적합한 설정으로 레이저 전력을 조정합니다. 1% 레이저 파워, 800 게인을 사용하여 배아를 이미징하여 시작하고 포화 픽셀이 보일 때까지 레이저 파워를 1% 씩 천천히 증가시다.
   2. 포화 픽셀이 더 이상 보이지 않는 때까지 레이저 파워를 약간 줄임으로써 이 작업을 수행하십시오.
      참고: 배아의 화상 진찰 세션의 시작을 위해 선택된 레이저 힘은 초기 시간 점에 좋을 지도 모르지만 세포의 형광이 시간이 지남에 따라 훨씬 밝거나 어두워지는 경우에 나중에 시점에서 이상적이지 않을 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 전기 포어화 된 세포가 일반적으로 전기 천공 후 처음 6 시간 동안 더 밝아지기 때문에 초기에 약간 낮은 전력 설정에서 배아를 이미지화하십시오 (신호 증가의 정량화에 대한 그림 3A-E 참조). 이후 이미지의 포화 상태인 경우 원래 이미징 설정으로 이미지를 계속 하지만 이미징 설정이 약한 경우(핀홀이 작거나 레이저 전원이 약한 경우) 즉시 추가 이미지를 촬영합니다.
   3. 다른 시간 점에 걸쳐 개별 세포 이동을 추적하기 위해 배아를 3-5 분마다 이미지화하십시오. 이 작업을 위해, 심상은 전체 전기 공극 영역의 z 스택 (~50 μm 두께) 및 그리고 z 스택의 바닥을 향해 몇 가지 여분의 공간을 더한 후 배아가 이미징 세션 내내 아가로즈 침대로 가라앉을 경우에 대비하여.
   4. 첫 번째 동영상의 처음 몇 시간 지점을 확인하여 셀이 얼마나 빠르게 움직이는지 관찰합니다. 셀이 빠른 속도로 이동하는 경우(즉, 이미지 영역의 영역을 몇 번 더 시간 지점 내에서 종료한다는 의미) 이미지 영역의 확대(1x à 0.8x)를 확장하거나 다른 영역을 이미징하는 것이 좋습니다.
      참고: 지역 pellucida에 있는 배아 지구는 지역 opaca에 있는 그 것 보다는 훨씬 더 급속하게 움직입니다. 추가적으로, 더 젊은 태아 (HH3, HH5)는 수시로 오래된 태아에 비해 더 급속한 운동을 겪고 있는 세포를 포함합니다 (>HH7).
   5. 배아의 전기포질 영역을 이미징한 후, 동일한 배아의 비전기 화 영역을 이미지화하여 자가형광 수준을 결정합니다(낮은 레이저 전력 및 10%가 배아를 이미지화하는 데 사용되는 경우 최소해야 함).

6. 분석 mRNA 무결성에 광 표백 후 형광 회복 (FRAP)

참고: 광표백 (FRAP) 분석 후 생체 내 형광 회복은 얼마나 오래 형질 감염된 mRNA가 FPs로 번역 될 수 있는지 를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 H2B의 반감기를 검출하기 위한 FRAP 실험을 간략하게 설명합니다. 전기 배아에서 시트린 mRNA.

1. 20x 0.8 NA 대점과 완전히 열린 핀홀을 사용하여 반전된 공초점 현미경에서 FRAP 실험을 수행합니다.
   1. 입체 현미경에 H2B-Citrine의 전기 천공을 확인하고 반전 된 공초점 현미경 (단계 5.2.4 참조)에 예열 된 단계에 배아를 설정 한 후, 다양한 시간에 H2B-Citrine에서 세포 형광의 대부분을 광 표백 포인트 (45 분, 2 시간, 및 5 시간 후 전기 천공) 70 % 레이저 전력, 100 반복, 스캔 속도 4, 남아있는 형광의 5 %를 가진 405 nm 레이저를 사용하여.
      참고: 이 프로세스는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
   2. 광표백 후 36°C에서 배아를 계속 배양한다.
2. 광표백 된 세포가 치료 후 완전히 사망하지 않았다는 것을 나타내는 광 표백 부위 내에서 세포를 적극적으로 분할하는 데주의를 기울여야합니다.
3. 공초점 현미경을 사용하여 일정한 시간 간격(3 또는 5분)에서 최대 30분 동안 표백 후 이미지(전기 포어 영역의 z 스택)를 획득합니다.
   참고: 가능한 경우, 광표백 영역에서 세포 생존을 보장하기 위한 양성 대조군으로서 형질전환 H2B-XFP 라인을 사용한다. 전기 포이터mRNA에 의해 인코딩된 FP에 대한 형광 회복속도는 감소해야 하지만, 이식유전자를 통해 인코딩된 FP의 경우 전체 영화 전체에 걸쳐 일관되게 유지되어야 한다.
4. 화상 진찰 조건이 배아 생존에 해로울 수 없다는 것을 확인하기 위하여는, 동시에 화상 진찰을 위한 통제로 봉사할 수 있는 광표백되지 않는 배극화한 태아를 배양합니다.
5. mRNA 붕괴 후 전기 천공에 대한 광표백 결과를 양량화하려면 ImageJ를 사용하여 각 세포의 중심(7.5 μm 원)의 형광 강도를 측정하여 시간(3 또는 5분)에 걸쳐 세포 형광을 추적합니다. 유사분열을 겪고 있지 않고 완전히 광표백된 광표백 부위 내의 모든 세포에 대해 이 것을 측정합니다.
   참고: 미소 핵은 염색질 응축으로 인한 상간 핵보다 더 강한 형광을 가지고 있기 때문에 정량화에서 미토틱 세포를 생략하는 것을 고려하십시오.
6. 다양한 시간 포인트(45분, 2시간 및 5시간)에서 표백 후 시간에 걸쳐 형광 강도를 플로팅합니다.

Results

mRNA 전기 화는 DNA 전기 화보다 더 효율적입니다.

우리는 pCS2 +를 사용했습니다. H2B-시트린은 시험관내 전사 mRNA를 준비한다. DNA 전기화는 일반적으로 1-2 μg/μL에서 수행되기 때문에 mRNA 전기화에 대해 mRNA(H2B-Citrine의 경우 약 0.25-0.5 μg/μL로 계산)의 등쪽 농도를 사용했습니다. 우리는 먼저 pCS2+의 전기 개광 효율을 테스트했습니다. H2B-시트린 DNA는 H2B-시트린 mRNA(pCS2+의 SP6 프로모터로부터 전사된 체외에서)와 비교되었다. H2B-Citrine)을 HH5 메추라기 배아에 별도로 전기대기또는 mRNA를 전기화한 후 12시간 후 전기천공에서 전기화 효율을 검사하였다. DNA 전기천공은 일부 전기포지체에서 더 밝은 형광을 유도하지만, 널리 발현된 mRNA 인...

Discussion

이 프로토콜에서는 메추라기 배아를 가스투압하는 세포로 mRNA를 정밀하게 미세 주입하고 전기 포어하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공했습니다. 우리는 시험관 내 합성 mRNA 전기화가 메추라기 배아에서 형광 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 입증했습니다 (그림2 및 3). 전기 포공 mRNAs에서 번역된 H2B-시트린 단백질로부터의 형광은 ~ 20분 이내에 공초점 현미경검사법에 의해 검출될 수있고 시간 동안 FP 형광에서 증가하였다(그림 3,보충 영화1). 이것은 놀랍게도 빠르며 시트린^32,33에대한 추정 된 성숙 시간에 가깝습니다. DNA 벡터로부터 발현된 FPs는 2-3시간 후에 검출되었다(도 3,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI-HF	뉴잉글랜드 바이오랩스	R3136L
BglII	뉴잉글랜드 바이오랩스	R0144S
BsrG1-HF	뉴잉글랜드 바이오랩스	R3575S
NotI-HF	뉴잉글랜드 바이오랩스	R3189L
SalI-HF	뉴잉글랜드 바이오랩스	R3138L
페놀:클로로포름:이소아밀 알코올	써모 피셔
SP6 mMessage 기계 체외 전사 키트	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI	시그마 알드리치	D9542	2-(4-아미디노페닐)-6-인돌레카르바미딘 디하이드로클로라이드, 4&프라임;,6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드, DAPI 디하이드로클로라이드
Whatman No.1 여과지	시그마 알드리치	WHA1001125
글리세롤	시그마 알드리치	G9012
우레아	시그마 알드리치	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. 방법 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		이 논문
pCS.H2B-citrine	Addgene	53752	pCS-H2B-citrine은 Sean Megason(Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry는 Sean Megason(Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 도립 현미경	Carl Zeiss Microscopy GmbH		LSM-780은 중요한 이미징 작업에 필요한 감도를 제공하는 컨포칼 및 다광자 현미경입니다. 전동 스테이지, 자동 초점 장치 및 풀 스테이지 탑 암막 인큐베이터가 장착된 780은 고급 라이브 셀/배아 이미징을 위한 탁월한 현미경입니다. 고감도 32채널 Quasar 검출기는 스펙트럼 이미징, 선형 불혼화 및 높은 색 수(>4) 이미지 획득을 가능하게 합니다. 여기는 6개 라인 단광자 레이저(405, 458, 488, 514, 564 및 633nm), 카멜레온(Coherent) 2광자 레이저(690nm - 1000nm 범위)로 수행할 수 있으며 ZEN 2011 SP7(Black) 시스템 소프트웨어로 실행할 수 있습니다.
CUY-21 EDIT 생체 내 전기천공기	Bex Co., Ltd.
백금 플랫 사각 전극, 측면 길이 5mm	Bex Co., Ltd.
Olympus MVX10 FL 스테레오 현미경	Olympus LifeScience
XM10 흑백 카메라	Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4)			1 L의 10× 원액을 준비하려면 80g의 NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2g의 KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4g의 Na2HPO4 (무수; Sigma-Aldrich S3264) 및 2.7g의 KH2PO4 (무수; Sigma-Aldrich P9791). HCl로 pH를 7.4로 조정하고 초순수 H2O로 최종 부피를 1L로 가져옵니다. HCR을 위해 PBS에서 CaCl2 및 MgCl2를 사용하지 마십시오. HCR용 PBS는 RNase-free 용액(예: 디에틸피로카보네이트[DEPC] 처리를 통해)으로 준비되는 것이 중요합니다.
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443)의 1개 mL와 10×의 100개 mL를 추가하십시오; PBS를 초순수 증류 H2O 890mL로 0.2°C를 통해 용액을 여과합니다. m 필터링하여 4에 보관 ? C를 사용할 때까지.
1× 인산염 완충된 염분 (PBS) (DEPC 대우하는; PH 7.4)
0.1% 트리톤 X-100