이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC). 설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.
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이 논문에서
요약
초록
면역 조직 화학 (IHC)를 위한 고품질 마우스 눈 단면도의 준비는 망막 구조물 및 기능을 평가하고 망막 질병의 근본적인 기계장치를 결정하기를 위해 중요합니다. 조직 준비 전반에 걸쳐 구조적 무결성을 유지하는 것은 재현 가능한 망막 IHC 데이터를 얻는 데 필수적이지만 망막 세포아키텍처의 취약성과 복잡성으로 인해 어려울 수 있습니다. 10% 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강한 고착제는 망막 구조를 최적으로 보존하며, 종종 배경 형광을 향상시키고 항체-에피토프 상호작용을 감소시킴으로써 IHC 분석을 방해합니다. 온화한 고착제는, 4% 파라포름알데히드와 같이, 배경 형광 및 에피토프 마스킹을 감소시키고, 세심한 해부 기술은 망막 구조물을 보존하기 위하여 이용되어야 합니다. 이 문서에서는, 우리는 망막 구조 무결성의 손실 없이 대부분의 항체 에피토프 상호 작용을 보존하기에 충분한 IHC를 위한 마우스 안구 후방 컵을 준비하는 포괄적인 방법을 제시합니다. 우리는 최적이고 최적이 아닌 조건 하에서 조직 보존 및 방향을 설명하기 위해 다양한 망막 세포 유형 마커에 대한 항체를 가진 대표적인 IHC를 포함합니다. 우리의 목표는 안구 후방 컵 해부에서 IHC에 완전한 프로토콜을 제공하여 망막의 IHC 연구를 최적화하는 것입니다.
서론
면역 조직 화학 (IHC)는 1,2,3의조직에서 특정 단백질 과 세포 구조를 국소화하기위한 강력한 기술입니다. 복잡한 조직의 부적절한 고정 방법 및 최적 절편은 조직 구조를 방해하거나, 높은 배경 염색을 생성하거나 항체 에피토프 상호 작용을 감소시켜 유물을 염색하고 결과적으로 잘못된 해석을 초래할 수 있습니다. IHC 데이터4. 척추동물 망막은 상호 연결된 광수용체, 인터뉴런 및 신경절 세포의 지층으로 구성된 복잡하고 고도로 조직된 신경 기관이기 때문에 매우 취약하며 해부 및 절편 중에 쉽게 중단 될 수 있습니다. 마우스 눈 해부 및 면역 염색에 이르는 상세하고 표준화되고 검증된 프로토콜은 IHC 아티팩트를 크게 감소시켜 결과의 신뢰성을 높이고 보다 정확한 비교 데이터를 가능하게 합니다. 분석.
IHC를 위한 조직 준비를 위한 많은 프로토콜이 있습니다, 그러나, 모두가 망막 조직을 위해 적당하지 않습니다. 10 % 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강력한 고정제는 해부 및 절편동안망막 구....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 실험실 동물 자원 연구소에서 제공하는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건 원의 권고사항에 따라 엄격하게 수행되었으며, 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회.
메서드에 대한 모든 도구와 장비는 그림 1에 나와 있으며 재료표에 나열되어 있습니다.
1 . 마우스 눈 핵, 눈 컵 해부 및 포함
- 이산화탄소 (CO2)를 가진안락사 마우스는 참수 (산후 마우스 P0 - P11) 또는 자궁 경부 탈구 (성인 >P11 마우스)에 의해 뒤따릅니다. P0-P14 마우스의 경우, 눈은 피부로 덮여 있습니다. 후속 단계 전에 피부를 제거하십시오.
- 꼬리 소작기를 사용하여 각막을 약간 연소시켜 눈의 측두체 부분을 표시합니다(그림2A). 각막을 매우 가볍게 만져서 각막에 구멍을 뚫지 말고 소작으로 1 초 이상 두지 마십시오.
- 구부러진 Dumont #5/45 포셉을 사용하여 마우스 눈을 즉시 enucleate합니다. 1.5 mL 저온 튜브에서 1mL의 파라포름알데히드(....
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결과
이러한 프로토콜이 IHC에 대한 최적의 망막 보존을 보장하는 방법을 설명하기 위해, 우리는 P28 WT 마우스 (C57BL / 6N)에서 로도프신(광수용체 마커)에 대한 항체로 망막 절편을 8, 글루탐산 데카르복실라제 65 (Gad65, amacrine 세포)를 조사했습니다. 마커)9, 글루타민 합성체 (GS, 뮐러 세포 마커)10,및 칼빈딘 (수평 세포 마커)11 (도 4). IHC는 우리의 프로토콜이 지속적으로 높은 품질과 잘 보존 된 망막 섹션을 산출한다는 것을 나타냅니다. 특히, 로도신이 풍부한 내부 및 외부 세그먼트는 망막 색소 상피 (RPE)(그림 4A)를 겹치게하는 것을 거의 또는 전.......
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토론
마우스 망막 절제술은 마우스 눈의 작은 크기와 모양과 망막 조직의 취약성으로 인해 섬세한 과정입니다. 고품질 해부를 수행하는 것은 연습의 문제이지만, 상세한 프로토콜을 갖는, 효율적인 방법과 팁을 제공하는 것은 망막 절편과 IHC를 얻기 위해 필수적이다. 여기에 설명된 프로토콜 외에도 재현 가능한 IHC에 적합한 일관된 고품질 망막 섹션을 허용하는 몇 가지 팁이 있습니다.
해부를 시작하기 전에, 편안하고 편안하고 마우스 눈 미세 해부 동안 최적의 시력을 위한 실내 조명을 설정하는 것이 중요합니다. 눈을 해부하면서 마우스 아이 컵 모양을 유지하기 위해, 우리는 사용자 정의 만든 왁스 코팅 해부 접시에 PBS에 잠긴 눈을 유지하는 것이 좋습니다. 우리는 밝은 분홍색 색깔의 치과 왁스 (그림1C)로35mm 해부 접시를 코팅하는 것이 좋습니다. 실제로, 치과 왁스의 밝은 분홍색 색상은 해부 범위에서 쉽게 눈 구조를 볼 수있는 적절한 .......
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감사의 글
이 작품은 NIH (RO1-GMO97327)와 대학 연구 재단 (UPenn)의 기금에 의해 지원되었다. 우리는 특히 면역 조직 화학 프로토콜, 고든 루텔 (펜실베니아 대학) 및 현미경 검사법과 레슬리 킹, 이 원고를 읽는 중요한 박사에 대한 지원을 위한 펜실베니아 수의사 이미징 코어를 개발하는 그녀의 도움에 대한 스베틀라나 사비나 감사 .
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참고문헌
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H.
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