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방법 논문

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59692

⸱

2019년 6월 20일

 ,  ,  , 
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

이 논문에서

요약

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 조각을 재현하고 안정적으로 광학 기록 하는 방법을 소개합니다. 이 기사에서는 기존의 해마 슬라이스 준비를 사용하여 전압에 민감한 염료 염색 및 광 신호 기록에 대해 설명합니다.

초록

뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 에민감한 염료(VSD) 이미징은 신경 회로의 기능적 연결을 평가하는 유용한 도구입니다. 광 신호의 분수 변화로 인해, 이 방법을 정량적 분석법으로 사용하기가 어려웠다. 이 문서에서는 이 기술을 안정적이고 신뢰할 수 있는 특수 광학 및 슬라이스 처리 시스템에 대해 설명합니다. 본 기사에서는 VSD 염색 해마 슬라이스의 슬라이스 처리, 염색 및 기록을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 좋은 염색과 함께 오랜 시간 동안 생리 적 조건을 유지하고, 기록 하는 동안 슬라이스의 기계적 움직임을 방지합니다. 또한 소량의 염료로 조각을 염색 할 수 있습니다. 광학 장치는 낮은 배율에서 높은 수치 조리개를 구현하여 100픽셀 x 100픽셀 공간 해상도로 최대 프레임 속도 10kHz에서 VSD 신호를 기록할 수 있습니다. 높은 프레임 속도와 공간 해상도로 인해 이 기술은 신경 회로의 변화를 평가하기에 충분한 신호 대 잡음 비를 제공하는 사후 기록 필터를 적용합니다.

서론

대량 염색 된 뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 감응염 (VSD) 이미징은 신경 회로 1, 2,3,4의 역학을 평가하는 유용한 정량적 도구가되었습니다. . 멤브레인 여기5,6,7,VSD 이미징으로 인한 광학 적 특성의 변화를 분석 한 후 1970 년대 초에 코헨 및 기타6,8에 의해 처음 기재되었습니다. 9. . 염료가 막 전위 변화(즉, 뉴런의 1차 신호)를 직접 프로브하기 때문에 실시간으로 뇌 기능을 모니터링하는 적절한 방법이다.

초기 VSD는 뇌 계통을 이해하는 바람직한 특성을 가지고, 이러한 빠른 시간 상수 와 같은 뉴런 막 전위 사건의 급속한 역학을 따르고, 멤브레인 전위 9의 변화와선형성 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14세 , 15. 다른 이미징 실험과 유사하게,이 기술은 원하는 결과를 달성하기 위해 카메라, 광학, 소프트웨어 및 슬라이스 생리학과 같은 광범위한 특정 튜닝을 필요로합니다. 이러한 기술적 함정 으로 인해 초기 노력 중 예상되는 이점은이 기술을 전문으로하지 않은 대부분의 실험실에서 반드시 구체화되지는 않았습니다.

기술적 난이도의 원초적 원인은 슬라이스 제제의 대량 염색에 적용될 때 멤브레인 전위 변화에 대한 VSD의 낮은 민감도였다. 광 신호의 크기(즉, 형광의 분수 변화)는 일반적으로 생리적 조건하에서 대조군(F0) 신호의 10-4-10-3이다. 뉴런의 막 전위 변화의 시간 척도는 약 밀리초에서 수백 밀리초까지입니다. 뉴런의 멤브레인 전위 변화를 측정하기 위해 레코딩에 사용되는 카메라는 고속(10kHz ~ 100Hz)의 이미지를 획득할 수 있어야 합니다. VSD의 낮은 감도와 신경 신호를 따르는 데 필요한 속도는 높은 신호 대 잡음 비 (S / N)2,16으로고속으로 카메라에서 많은 양의 빛을 수집해야합니다.

레코딩 시스템의 광학 장치는 충분한 빛의 수집을 보장하고 S/N을 개선하는 데 중요한 요소입니다. 광학에 의해 달성된 배율은 종종 국소 기능신경회로를 가시화하기 위해 1X ~ 10X와 같이 지나치게 낮습니다. 예를 들어, 해마 회로의 역학을 시각화하기 위해 약 5의 배율이 적합할 것입니다. 이러한 낮은 배율은 낮은 형광 효율을 가지고; 따라서 고급 광학은 이러한 기록에 도움이 될 것입니다.

또한 슬라이스 생리학도 필수적입니다. 이미징 분석에는 슬라이스가 손상되지 않도록 해야 하므로17. 또한, 더 긴 시간 동안 슬라이스 생존을 유지하기 위해 취한 조치는 중요하다18.

이 문서에서는 슬라이스, VSD 염색 및 측정을 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 문서에서는 또한 VSD, 이미징 장치 및 광학에 대한 개선 사항 및 이 방법을 간단하고 강력하며 정량적 분석으로 사용할 수 있게 한 실험 시스템에 대한 기타 추가 개선 사항에 대해 설명합니다. 뇌 기능의 수정19,20,21,22,23,24,25. 이 기술은 또한 해마 슬라이스1의CA1 영역에서 장기 적인 약식에 널리 사용될 수 있다. 더욱이, 이 기술은 단일 신경 세포(26)에서막 전위(26)의 광학 기록에도 유용하다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 도쿠시마 분리 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 슬라이스 준비를 위한 다음 프로토콜은 거의 표준 절차 27이지만, 수정은 VSD로 염색 및 기록의 프로토콜이었다.

1. 실험일 전준비

  1. 재고 A (표1),재고 B (표2),및 재고 C (표3)솔루션을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
  2. 인공 뇌척수액 1L(ACSF)(표4, 3단계 참조)를 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
  3. 수정된 ACSF 1L(표 5)을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
  4. 2 mL 바이알에 태아 소 혈청 (FBS)의 500 μL aliquots를 분배하고 냉동실에 보관하십시오.
  5. 한천 분말의 4%를 전자레인지에 120mL에 녹여 90mm 일회용 페트리 접시에 붓습니다. 한천 플레이트는 추가 사용 전에 냉장 보관해야 합니다.
  6. 실험 전날 냉동실에 다음 품목을 놓습니다: 수술용 트레이, 슬라이서 용기 및 알루미늄 냉각 블록(120x 120 x 20 mm 3).
  7. 슬라이스 처리 시스템17,28(단계 6.12 참조)에 멤브레인 필터가 있는 플렉시 유리 링이 충분한지 확인하십시오.
  8. 한천 파우더의 2%를 50 mL의 3M KCl에 전자레인지에 녹입니다. 접지 전극을 위한 마이크로파이펫을 사용하여 200 μL 팁에서 따뜻한 아가-KCl 용해물의 약 85 μL을 취하십시오. 팁을 따뜻한 한천 3M KCl 젤에 분리합니다. 이 단계를 반복하여 약 20-40개의 팁을 2% 한천으로 채웁니다.

2. VSD (di-4-ANEPPS) 주식 솔루션의 준비

  1. 초순수로 1mL의 10% 폴리에톡설화 피마자유 용액을 준비합니다.
  2. 디-4-ANEPPS(5 mg 바이알), 와류 및 초음파 처리재 10분 동안 1 mL의 에탄올을 바이알에 넣습니다. 용액은 di-4-ANEPPS 결정의 가능한 작은 잔류물로 깊은 붉은 색으로 변합니다.
    참고: 이 단계에서 사용되는 에탄올은 새로 열어야 합니다.
  3. O 링이 있는 2mL 마이크로튜브로 솔루션을 전송합니다. 용액을 스핀다운하고 10% 폴리에톡설화 피조물 오일 용액 500 μL을 추가합니다.
    참고: 염료는 매우 친유성입니다. DMSO 및 폴록사머는 di-4-ANEPPS를 용해시키는 데에도 사용될 수 있지만 멤브레인 전위 변화에 따른 광 신호의 관점에서, 우리는 에탄올-폴리에톡설화 피장 오일의 사용이 소음 비에 더 나은 신호를 제공한다는 것을 발견했습니다. 이는 세포막으로의 용매의 전달 속도와 관련될 수 있다.
  4. 염료가 완전히 용해 될 때까지 소용돌이 및 초음파 처리하십시오.
  5. 빛에 노출되지 않도록 하고 냉장고에 보관하십시오. 냉동실에 보관하지 마십시오. 주식은 몇 달 동안 지속될 수 있습니다.
    참고: 실험 당일, 3-9단계를 따른다.

3. ACSF의 일일 준비 (1 L) (표 4)

  1. NaCl, NaHCO3및 플라스크에 포도당을 계량하십시오.
  2. 플라스크에 950 mL의 증류수를 넣고 95% O 2/5% CO2 가스로 버블링을 시작합니다.
  3. 2.5 mL의 스톡 A 용액을 플라스크에 넣고 실온에서 약 10분 동안 배양합니다.
  4. 플라스크에 2.5 mL의 스톡 C 용액을 추가합니다.
  5. 증류수를 추가하여 1L에 용액을 만듭니다.

4. 염색 VSD 용액의 일일 준비

  1. 5분 동안 초음파 초음파 처리기에서 FBS 및 VSD 스톡 솔루션(2단계)의 500 μL 바이알을 초음파 처리합니다.
  2. FBS 의 유리병에 갓 준비된 ACSF 500 μL을 추가합니다.
  3. 바이알에 VSD 스톡 용액의 20(마우스의 경우) 또는 40(쥐의 경우) μL을 첨가한다.
  4. 용액이 옅은 주황색이 될 때까지 유리병을 초음파 및 소용돌이.

5. 수술 준비

  1. 냉장 ACSF 100mL를 300mL 스테인리스 스틸 용기, 300mL 비커 및 플라스틱 용기에 별도로 넣고 냉동실에 보관하십시오. 다른 비커에 150 mL의차가운 변형 ACSF (표 2)를 부어 냉동실에 넣습니다. 솔루션이 냉각 될 때까지 기다립니다. 사전에 측정하고 결정해야 합니다.
  2. 면도날(카본 강, 산업용 등급 0.13mm 두께, 양쪽 블레이드)을 슬라이서의 절반으로 부수도록 접습니다.
    참고: 나머지 절반은 적절한 블레이드 홀더로 해부에 사용할 수 있습니다.
  3. ACSF 에서 블록을 준비 4% 한천 플레이트 조정지그 (그림 1).
  4. 습한 인큐베이션 챔버(계면 형 챔버; 변형된 1.2L 밀봉 된 상자와 실리콘 패킹)를 준비하여 뇌 조각을 생리적으로 살아 있게 유지한다 (도2); ACSF를 95% O 2/5% CO2 가스로 작은 용기에 넣고 탄산염을 넣고 ACSF가 있는 90mm x 20mm 페트리 접시를 맨 위에 채웁니다.
    참고: 작은 페트리 접시 (60mm x 20mm)는 접시에 여과 지를 지원하기 위해 90mm 접시의 중앙에 배치해야합니다.
  5. 가열 장치에 상자를 넣고 28 °C까지 따뜻하게 20 분 동안 기다립니다.
  6. 분쇄된 얼음을 슬라이서 용기에 넣습니다. 얼음 위에 스테인리스 스틸 통(작은) 악기를 놓습니다: 메스, 블레이드 홀더, 링 핀셋, 한천 블록, 슬라이서 스테이지. 냉동 ACSF 및 수정 된 ACSF를 얼음과 거품에 95 % O2/ 5 % CO2 가스 (일명 카보겐)로 유지하십시오.
  7. 가위(크고 작은), 핀셋, 주걱, 숟가락, 대각선 펜치 등 다음 악기를 통(큰 것)에 놓습니다.

6. 수술 (생쥐)

  1. 연기 후드에 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취. 발가락 핀치시 동물의 페달 반사를 확인하여 마취 수준을 평가합니다.
  2. 마우스를 참수하고 스테인레스 스틸 수술 트레이에 얼음 차가운 ACSF에 머리를 담급니다.
  3. 1분 이내에 뇌를 추출하고 차가운 ACSF가 들어있는 비커에 5분 동안 넣습니다.
  4. 비커에서 뇌를 꺼내 메스를 사용하여 뇌 블록을 다듬습니다 (그림3A).
  5. 뇌 블록을 4% 한천 블록에 놓습니다(단계 5.3, 그림 3B). 두 반구는 한천 블록에 장착할 수 있습니다. 필터 용지로 블록에서 여분의 ACSF를 닦습니다.
  6. 슬라이서 테이블에 얇은 접착제 (슈퍼 접착제)를 적용합니다. 한천 블록을 놓고 여과지를 사용하여 여분의 접착제를 닦아냅니다.
  7. 뇌-한천 블록 상단에서 피펫을 사용하여 소량의 얼음 차가운 ACSF (~5 mL)를 부드럽게 바릅니다. 이것은 과잉 슈퍼 접착제를 고체화하고 접착제가 뇌를 덮고 슬라이스를 방해하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.
  8. 슬라이서 테이블을 슬라이서 트레이(그림3C)에고정하고 수정된 ACSF를 붓습니다.
  9. 슬라이서를 블레이드 주파수를 최대로 느린 속도로 설정합니다.
  10. 슬라이스 두께를 350-400 μm로 설정하고 슬라이스를 시작합니다(그림3C). 슬라이스 트레이의 모서리에 슬라이스를 순서대로 배치하여 슬라이스의 깊이를 쉽게 구별할 수 있도록 합니다. 일반적으로 한 반구에서 3~5개의 슬라이스를 얻을 수 있습니다.
  11. 30 G 바늘을 사용하여 뇌줄기부분을 잘라냅니다(그림 3D).
    참고: CA3-CA1 경계 사이 절단과 같은 두뇌 슬라이스에 미세 수술은 필요한 경우에 쌍안경 현미경의 밑에 이 단계에서 행해져야 합니다.
  12. 작은 기울어진 페인트 브러시를 사용하여 플렉시 글라스 링17 (외경 15mm, 내경 11mm, 두께 1mm, 그림 3E)으로보관된 멤브레인 필터 (0.45 μm 기공, PTFE 멤브레인, 13mm 직경)의 중앙에 슬라이스를 놓습니다. 링을 습한 회수 챔버에 놓고(그림 2) 커버를 고정하여 내부 압력을 높게 유지합니다.
    참고: 슬라이스는 30 분 이내에 멤브레인에 달라 붙어 기록 챔버의 후속 단계에서 링으로 처리 할 수 있습니다. 슬라이스를 제자리에 유지하기 위해 가중치 나 다른 조치를 사용할 필요가 없습니다.
  13. 링의 슬라이스 방향과 위치를 조정하여 잘 중앙에 배치되고 일관된 방향이 있는지 확인합니다(9.3 단계 참조).
  14. 시편을 28°C에서 30분 동안 방치한 다음, 슬라이스 회수를 위해 실온에서 10 내지 30분 이상 방치한다.
    참고: 슬라이스는 이제 적어도 15 시간 동안 좋은 생리 적 상태를 유지할 수 있습니다.

7. 슬라이스의 염색 및 헹구기 (생)

  1. 마이크로파이펫을 사용하여 링의 각 슬라이스에 염색 용액(4단계)의 100-110 μL을 부드럽게 바릅니다. 4단계에서 제조된 하나의 염색용액으로 8~9개의 슬라이스를 염색할 수 있다. 얼룩을 위해 슬라이스를 20분 동안 그대로 둡니다.
  2. 용기에 ACSF 50-100 mL을 준비하고 염색 용액을 헹구기 위해 슬라이스 된 표본이있는 링을 넣습니다.
  3. 헹위된 슬라이스를 다른 배양실에 보관합니다. 실험 전에 복구를 위해 1 시간 이상 기다립니다.
    참고: 인큐베이션 챔버는 가스로부터 분리되고 단단한 밀봉 된 상태에서 기록장소로 이동될 수 있다. 슬라이스는 가스 공급없이 적어도 20 분 동안 살아 있을 수 있습니다. 이 기능은 기록을 위해 슬라이스를 다른 장소로 이동해야 하는 경우에 유용합니다.

8. 실험 기구의 일일 준비

  1. 앰프, 컴퓨터 및 카메라 시스템을 켜고 소프트웨어가 실행 중인지 확인합니다.
  2. ACSF를 50 mL 튜브에 놓고 카보겐으로 거품을 냅니다.
  3. 연동 펌프를 사용하여 ACSF를 순환시킴. 유량을 약 1mL/min으로 조정합니다.
  4. 실험실 내부의 액체 레벨이 항상 일정하게 유지되도록 흡입 파이펫의 높이를 조정합니다.
    참고: 용액의 레벨은 안정적인 기록을 얻기 위해 중요하므로, 조정은 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행해야한다.
  5. 3M KCl 한천으로 채워진 노란색 칩으로 구성된 접지 전극 설치 (2%) (1.8단계)을 3M KCl 용액의 소량으로 Ag-AgCl 와이어를 가진 홀더에 넣습니다.
  6. 소량의 ACSF(부피의 약 2/3)를 테이퍼된 얇은 튜브 옐로우 팁을 사용하여 유리 전극(1mm 외경, 0.78mm 내경 0.78mm 내경)에 채우고 전극 홀더에 넣습니다.
  7. 조작기에 설치된 로드에 홀더를 부착합니다. 전극 저항이 약 1MΩ인 앰프를 사용하십시오.
    참고: 긴 생크 와이드 개구부(4-8 μm 개구부) 패치 형 전극은 현장 기록 및 자극 전극으로서 양호해야 한다.

9. 레코딩 세션 시작

  1. 집게와 촉촉한 챔버에서 슬라이스 준비를.
  2. 슬라이스를 현미경 아래 실험 챔버에 빠르게놓습니다(그림 4).
  3. 링의 가장자리를 실리콘 O 링에 단단히 밀어 넣습니다. 실험실의 막이나 바닥을 부러뜨리지 않도록 주의하십시오.
    참고: 슬라이스의 방향은 시야에서 전극을 자극하고 기록하는 방향에 대하여 고려되어야 한다. 건강한 슬라이스는 멤브레인 필터에 달라붙어서 가중치 및 나일론 메세와 같은 슬라이스를 수정하기 위해 다른 장치를 사용할 필요가 없습니다.
  4. 자극 전극의 팁과 필드 전위 기록 전극을 투과된 빛으로 현미경 아래의 슬라이스에 놓습니다.
  5. 전기 생리학적 기록 시스템을 사용하여 응답을 확인합니다. 주어진 구성으로 일반적인 (얼룩이 없는) 전기 생리학적 기록을 확인합니다.
    참고: 기록 전극은 생략할 수 있지만 슬라이스의 생리학을 확인하는 데 유용하다.
  6. 5x 침지 대물렌즈와 1x PLAN APO 튜브 렌즈로 10kHz에서 샘플링할 때 시편에서 13-15mW/cm2에 해당하는 카메라의 최대 용량의 약 70-80%로 여기 광 강도를 조정합니다. 여기 광 파지는 530 nm이고 방출 필터는 > 590 nm이어야 합니다.
    참고: 셔터를 사용하여 여기 빛의 양을 최소화합니다. 지속적인 빛 노출은 슬라이스 생리학을 악화시킬 수 있다. 빛의 가능한 유해한 효과는 빛의 강도와 지속 시간에 따라 달라집니다. 빛의 효과를 판단하기 위해 전기 생리학적 기록을 사용합니다. 13-15 mW / cm 2의강도의 경우, 약 1 s 노출 허용 오차의 상한이어야한다.
  7. 형광광원을 이용하여 수집 시스템으로 초점을 조정하는 것은 초점이 파장에 따라 다를 수 있기 때문에 수집을 시작한다.
  8. 이미지 수집 소프트웨어의 데이터를 검사합니다.
    참고: 우리는 상세한 분석을 위해 수치 분석 소프트웨어의 원래 마이크로 프로그래밍 패키지를 사용했다.

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결과

도 5는 마우스 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 샤퍼 담보의 전기 자극 시 대표적인 광 신호를 나타낸다. 그림 5A의 연속된 이미지는 공간 및 시간 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 표시하는 반면, 그림 5B는 5 x 5 x 5 입방 필터(가우시안 커널 컨볼루션, 5 x 5 공간- 및 5)를 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니다. 시간 차원) 두 번. 높은 프레임 속도(0.1 ms/frame)와 높은 공간 해상도(100픽셀 x 100픽셀)로 인해 필터의 적용은 신호를 변경하지 않고 노이즈를 필터링하여 단일 시험에서 픽셀로 기록된 시간 코스에서도 관찰할 수 있습니다( 그림 5C,필터 없음; 도 5D,필터; 그...

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토론

슬라이스 생리학은 올바른 신호를 수집하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에서 링 멤브레인 필터 시스템을 사용하면 절차 2,16및17에서 슬라이스가 건강하고 왜곡되지 않은 상태로 유지됩니다. 다른 시스템은 기록 하는 동안 슬라이스 생리학을 유지 하는 데 사용할 수 있습니다., 하지만 이미징 건강 한 슬라이스의 모든 부분을 필요로 하는 슬라이스는 언제 든 지 변형 되지 않아야. 링 멤브레인 필터 시스템은 필요한 염색 용액의 부피를 최소화하는 데 도움이하므로 염색에도 좋습니다. 시간 분획에 대해 낮어야 하므로 여기 빛의 강도를 제어하는 것도 중요합니다. 연속 조명은 시편을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 셔터를 적절히 사용해야 합니다.

VSD의 독성은 종종 29논의되었지만, 염료 농도, 여기 광 강도 및 빛에 대한 노출 기...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

TT는 JSPS 카켄히 그랜트 (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K00038, JP15K00413) 및 후생노동성(MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 및 H30 [1806216])의 보조금. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고속 이미지 취득 시스템Brainvision co., Ltd.MiCAM - Ultima이미징 시스템
고속 이미지 획득 시스템Brainvision co., Ltd.MiCAM 02
광시야 이미징을 위한 이미징 시스템 MacroscepeBrainvision co., Ltd.THT macroscopemacroscope
사진 diodode stablilizer를 가진 고성능 LED 조명 체계Brainvision co., 주식 회사.LEX-2GLED 조명
이미지 취득 소프트웨어Brainvision co., Ltd.BV-ana이미지 수집 소프트웨어
다기능 전기 자극기Brainvision co., Ltd.ESTM-8자극 아이솔레이터 + AD/DA 컨버터
슬라이서라이카VT-1200S슬라이서
라이카VT-1000슬라이
블레이드 슬라이서 용 날개깃털 안전 면도기 (주)#99027탄소강 면도날
슬라이스 지원용 멤브레인 필터Merk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µ m pores,membranefilter/0.45 13
수치 분석 소프트웨어Wavemetrics Inc., OR, USAIgorPro분석 소프트웨어
자극 아이솔레이터WPI Inc.A395자극 아이솔레이터
AD/DA 컨버터InstrutechITC-18AD/DA 컨버터
전압 민감형 염료 Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA카탈로그 번호: D-1199VSD: Di-4-ANEPPS
PoloxamerInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MPPoloxamer/Pluronic F-127 (DMSO의 20% 용액)
폴리에틸렌 피마자 기름시그마 - 알드리치크레 모퍼 EL C5135폴리 에 톡 실 피마자 기름
서

참고문헌

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