방법 논문

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

DOI:

10.3791/59692

⸱

2019년 6월 20일

 ,  ,  , 
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 조각을 재현하고 안정적으로 광학 기록 하는 방법을 소개합니다. 이 기사에서는 기존의 해마 슬라이스 준비를 사용하여 전압에 민감한 염료 염색 및 광 신호 기록에 대해 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 에민감한 염료(VSD) 이미징은 신경 회로의 기능적 연결을 평가하는 유용한 도구입니다. 광 신호의 분수 변화로 인해, 이 방법을 정량적 분석법으로 사용하기가 어려웠다. 이 문서에서는 이 기술을 안정적이고 신뢰할 수 있는 특수 광학 및 슬라이스 처리 시스템에 대해 설명합니다. 본 기사에서는 VSD 염색 해마 슬라이스의 슬라이스 처리, 염색 및 기록을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 좋은 염색과 함께 오랜 시간 동안 생리 적 조건을 유지하고, 기록 하는 동안 슬라이스의 기계적 움직임을 방지합니다. 또한 소량의 염료로 조각을 염색 할 수 있습니다. 광학 장치는 낮은 배율에서 높은 수치 조리개를 구현하여 100픽셀 x 100픽셀 공간 해상도로 최대 프레임 속도 10kHz에서 VSD 신호를 기록할 수 있습니다. 높은 프레임 속도와 공간 해상도로 인해 이 기술은 신경 회로의 변화를 평가하기에 충분한 신호 대 잡음 비를 제공하는 사후 기록 필터를 적용합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대량 염색 된 뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 감응염 (VSD) 이미징은 신경 회로 1, 2,3,4의 역학을 평가하는 유용한 정량적 도구가되었습니다. . 멤브레인 여기5,6,7,VSD 이미징으로 인한 광학 적 특성의 변화를 분석 한 후 1970 년대 초에 코헨 및 기타6,8에 의해 처음 기재되었습니다. 9. . 염료가 막 전위 변화(즉, 뉴런의 1차 신호)를 직접 프로브하기 때문에 실시간으로 뇌 기능을 모니터링하는 적절한 방법이다.

초기 VSD는 뇌 계통을 이해하는 바람직한 특성을 가지고, 이러한 빠른 시간 상수 와 같은 뉴런 막 전위 사건의 급속한 역학을 따....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 도쿠시마 분리 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 슬라이스 준비를 위한 다음 프로토콜은 거의 표준 절차 27이지만, 수정은 VSD로 염색 및 기록의 프로토콜이었다.

1. 실험일 전준비

  1. 재고 A (표1),재고 B (표2),및 재고 C (표3)솔루션을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
  2. 인공 뇌척수액 1L(ACSF)(표4, 3단계 참조)를 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
  3. 수정된 ACSF 1L(표 5)을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
  4. 2 mL 바이알에 태아 소 혈청 (FBS)의 500 μL aliquots를 분배하고 냉동실에 보관하십시오.
  5. 한천 분말의 4%를 전자레인지에 120mL에 녹여 90mm 일회용 페트리 접시에 붓습니다. 한천 플레이트는 추가 사용 전에 냉장 보관해야 합니다.
  6. 실험 전날 냉동실에 다음 품목을 놓습니다: 수술용 트레이, 슬라이서 용기 및 알루미늄 냉각 블록(120

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도 5는 마우스 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 샤퍼 담보의 전기 자극 시 대표적인 광 신호를 나타낸다. 그림 5A의 연속된 이미지는 공간 및 시간 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 표시하는 반면, 그림 5B는 5 x 5 x 5 입방 필터(가우시안 커널 컨볼루션, 5 x 5 공간- 및 5)를 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니다. 시간 차원) 두 번. 높은 프레임 속도(0.1 ms/frame)와 높은 공간 해상도(100픽셀 x 100픽셀)로 인해 필터의 적용은 신호를 변경하지 않고 노이즈를 필터링하여 단일 시험에서 픽셀로 기록된 시간 코스에서도 관찰할 수 있습니다( 그림 5C,필터 없음; 도 5D,필터; 그.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

슬라이스 생리학은 올바른 신호를 수집하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에서 링 멤브레인 필터 시스템을 사용하면 절차 2,16및17에서 슬라이스가 건강하고 왜곡되지 않은 상태로 유지됩니다. 다른 시스템은 기록 하는 동안 슬라이스 생리학을 유지 하는 데 사용할 수 있습니다., 하지만 이미징 건강 한 슬라이스의 모든 부분을 필요로 하는 슬라이스는 언제 든 지 변형 되지 않아야. 링 멤브레인 필터 시스템은 필요한 염색 용액의 부피를 최소화하는 데 도움이하므로 염색에도 좋습니다. 시간 분획에 대해 낮어야 하므로 여기 빛의 강도를 제어하는 것도 중요합니다. 연속 조명은 시편을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 셔터를 적절히 사용해야 합니다.

VSD의 독성은 종종 29논의되었지만, 염료 농도, 여기 광 강도 및 빛에 대한 노출 기.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT는 JSPS 카켄히 그랜트 (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K00038, JP15K00413) 및 후생노동성(MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 및 H30 [1806216])의 보조금. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고속 이미지 취득 시스템Brainvision co., Ltd.MiCAM - Ultima이미징 시스템
고속 이미지 획득 시스템Brainvision co., Ltd.MiCAM 02
광시야 이미징을 위한 이미징 시스템 MacroscepeBrainvision co., Ltd.THT macroscopemacroscope
사진 diodode stablilizer를 가진 고성능 LED 조명 체계Brainvision co., 주식 회사.LEX-2GLED 조명
이미지 취득 소프트웨어Brainvision co., Ltd.BV-ana이미지 수집 소프트웨어
다기능 전기 자극기Brainvision co., Ltd.ESTM-8자극 아이솔레이터 + AD/DA 컨버터
슬라이서라이카VT-1200S슬라이서
라이카VT-1000슬라이
블레이드 슬라이서 용 날개깃털 안전 면도기 (주)#99027탄소강 면도날
슬라이스 지원용 멤브레인 필터Merk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µ m pores,membranefilter/0.45 13
수치 분석 소프트웨어Wavemetrics Inc., OR, USAIgorPro분석 소프트웨어
자극 아이솔레이터WPI Inc.A395자극 아이솔레이터
AD/DA 컨버터InstrutechITC-18AD/DA 컨버터
전압 민감형 염료 Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA카탈로그 번호: D-1199VSD: Di-4-ANEPPS
PoloxamerInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MPPoloxamer/Pluronic F-127 (DMSO의 20% 용액)
폴리에틸렌 피마자 기름시그마 - 알드리치크레 모퍼 EL C5135폴리 에 톡 실 피마자 기름
서

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).
  2. Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문