방법 논문

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

DOI:

10.3791/59695

⸱

2019년 5월 21일

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

초록

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유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 진핵생물의 단백질 분해 및 기타 다양한 세포 과정의 주요 조절제입니다. 뇌에서, 유비퀴틴-프로테아좀 활동의 증가는 시냅스 가소성 및 기억 형성에 매우 중요하며, 이 시스템의 비정상적인 변화는 다양한 신경학적, 퇴행성 및 정신 장애와 관련이 있다. 두뇌에 있는 기능을 유비퀴틴 proteasome 공부에 있는 문제점의 한가지는 단백질 표적, 기능적인 역할 및 규칙의 기계장치가 넓게 변화할 수 있는 모든 세포 구획에 존재한다는 것입니다. 그 결과, 동일한 동물 내의 다른 세포 내 구획에서 뇌 유비퀴틴 단백질 표적화 및 프로테아좀 촉매 활성을 직접 비교하는 능력은 UPS가 시냅스 가소성에 기여하는 방법을 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 기억력과 질병을 앓고 있습니다. 여기에 설명된 방법은 동일한 설치류(쥐) 뇌에서 핵, 세포질 및 조시냅스 분획을 수집한 다음 프로테아좀 촉매 활성의 동시 정량화(간접적으로 프로테아좀 코어의 활성 제공)를 허용합니다. 만) 및 링키지 특이적 유비퀴틴 단백질 태깅. 따라서, 이 방법은 시냅스 가소성, 기억 형성 및 상이한 질병 상태 동안 동일한 동물의 상이한 뇌 영역에서의 유비퀴틴-프로테아좀 활성의 세포내 변화를 직접 비교하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 동일한 동물 내의 다른 단백질의 세포내 분포 및 기능을 평가하는데 사용될 수 있다.

서론

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유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 세포 1에서 대부분의 수명이 짧은 단백질의 분해를 제어하는 상호 연결된 단백질구조및 리가제의 복잡한 네트워크입니다. 이 시스템에서, 단백질은 작은 수정기 유비퀴틴에 의해 분해 또는 다른 세포 과정 / 운명에 대한 표시되어 있습니다. 표적 단백질은 7개의 리신(K) 부위(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63) 또는 이전 유비퀴틴 2에서 N-말단 메티오닌(M1; 선형으로 알려진) 중하나에서 함께 연결할 수 있는 1-7 유비퀴틴 변형을 획득할 수 있다. 이들 폴리비퀴틴 태그 중 일부는 분해 특이적(K48) 3이며, 다른 것들은 단백질 분해 과정(M1)4,5,6과크게 독립적이다. 따라서, 단백질 유비퀴틴화 과정은 믿을 수 없을 만큼 복잡하며 특정 폴리유비퀴틴 태그의 변화를 정량화하는 능력은 궁극적으로 세포 기능의 변형이 주어진 역할을 이해하는 데 매우 중요하다. 이 시스템의 연구를 더욱 복잡하게 하는, 프로테아좀은 UPS 7의 촉매

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프로토콜

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동물 과목을 포함한 모든 절차는 버지니아 폴리 테크닉 대학과 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 설치류 뇌 조직의 수집 및 해부

참고: 이 프로토콜은 다양한 뇌 영역에 적용될 수 있으며 다양한 조직 수집 절차와 함께 사용될 수 있습니다. 아래는 쥐 뇌 조직의 아세포에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하는 절차, 사용 하 여 8-9 주 오래 된 남성 Sprague Dawley 쥐. 동일한 동물의 모든 세포 구획을 처리하기 위해, 섹션 1.3. 사용된 조직 수집 절차에 관계없이 따라야 합니다.

  1. 쥐 의 뇌를 추출하고 드라이 아이스에 미리 차가운 극저온 컵에 배치합니다. 드라이 아이스에서 뇌를 플래시 동결하거나 가능한 경우 액체 질소를 사용하고 -80 °C 냉동고로 옮김을 사용하십시오. 뇌는 같은 날 또는 나중에 해부 될 수 있습니다.
  2. 극저온 컵에서 얼어 붙은 뇌를 제거하고 드라이 아이스로 차가운 쥐 뇌 매트릭스에 넣습니다. 행렬의 각 슬롯은 0.5mm에 해당하며, 관심 영역(ROI)의 대략적인 위치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
    1. 쥐 ....

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결과

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여기에 기재된 절차를 사용하여, 핵, 세포질 및 시냅스 분획을 쥐 뇌의 측측편도체로부터 수집하였다(도 1). 개별 분획의 순도는 서쪽 블로팅을 통해 확인되었고, 리세이트에서 농축되거나 고갈되어야 하는 단백질에 대한 항체를 조사했다. 조시냅스 분획이 수집된 제1 반구에서, 후층성 밀도 단백질 95(PSD95)는 세포질에서 더 낮은 수준으로 시냅스,분획이 아닌 시냅스에 존재하였다(도 2A). 이는 시냅스 분획 제제가 시냅스 전 및 후성 내피 성분둘다를 분리한다는 것을 입증하는 이전 작업과 일치한다(25). 반대로, 핵 단백질 히스톤 H3는 핵에 존재하였으나 시냅스, 분획, 세포질에서 더낮은 수준으로 존재하였다(도 2B). 세포질에서 PSD95 및 H3의 존재는 세포질 번역과.......

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토론

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여기에서, 우리는 동일 동물에 있는 다른 세포 내 구획에 걸쳐 유비퀴틴-proteasome 활동의 변경을 정량화하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 현재, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 활성에서 세포외 변화를 측정하는 대부분의 시도는 샘플당 단일 구획으로 제한되어 실험을 반복할 필요가 있다. 이것은 상당한 비용과 동물의 생명의 손실로 이어집니다. 우리의 프로토콜은 반구를 분할하여이 문제를 완화, 다른 세포 분획은 동일한 동물의 각 반구에서 수집 할 수 있도록. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 학습21에응하여 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 동일한 동물 유비퀴틴-프로테아좀 활성이 분별적으로 변화한다는 것을 처음으로 보여줄 수 있었다.

여기서 설명된 프로토콜의 주요 제한사항은 수득된 뇌 조직(샘플)의 양에 의존한다. 예를 들어, 위에서 설명한 대로 이 프로토콜은 주어진 뇌 영역의 반구를 분할해야 합니다. 그러나 한 반구에만 존재하는 특정 영역의 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 농업 및 생명 과학 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다 버지니아 공대에서 과학 대학. T.M.는 버지니아 공대의 조지 워싱턴 카버 프로그램에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M EDTAFisher15575020다양한 기타 공급 업체
20S 프로테아솜 활성 키트Millipore SigmaAPT280기타 공급 업체는 다른 버전을 제공합니다
ATPFisherFERR1441다양한 기타 공급 업체
베타 액틴 항체세포 신호4967S다양한 기타 공급 업체
베타 튜불린 항체세포 신호2128T다양한 기타 공급 업체
BioTek Synergy H1 플레이트 리더BioTekVATECHH1MT3기타 공급 업체는 다른 버전을 운반
B-mercaptoethanolFisherICN19024280다양한 기타 공급 업체
Clasto lactacystin b-lactoneMillipore SigmaL7035기타 다양한 공급 업체
극저온 컵Fisher033377B다양한 기타 공급 업체
DMSO DMSOD8418다양한 기타 공급 업체
DTTMillipore SigmaD0632다양한 기타 공급 업체
GlycerolMillipore SigmaG5516다양한 기타 공급 업체
H3 항체Abcam ab1791다양한 기타 공급 업체
HEPESMillipore SigmaH3375다양한 기타 공급 업체
염산FisherSA48기타 다양한 공급업체
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021기타 다양한 공급업체
K48, Ubiquitin 항체Abcamab140601기타 다양한 공급업체
K63, Ubiquitin 항체Abcamab179434기타 다양한 공급업체
KClMillipore SigmaP9541다양한 기타 공급업체
KONTES 조직 분쇄기VWRKT885300-0002다양한 기타 공급업체
Laemmli 샘플 버퍼Bio-rad,161-0737다양한 공급업체
선형 유비퀴틴 항체수명 센서AB-0130-0100M1 항체
MgClMillipore, 시그마442611기타 다양한 공급업체
마이크로 원심분리기Eppendorf2231000213다양한 기타 제조업체/모델
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500Carried by Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014다양한 기타 공급업체
Odyssey Fc Imaging SystemLiCor2800-02기타 공급업체는 다른 버전을 제공합니다
Phosphatase InhibitorMillipore Sigma524625다양한 기타 공급업체
: Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373다양한 기타 공급업체
프로테아제 억제제Millipore SigmaP8340다양한 기타 공급업체
PSD95 항체세포 신호 3450T다양한 기타 공급업체
, SDS,Millipore SigmaL3771다양한 기타 공급업체
: 수산화나트륨FisherSS255기타 다양한 공급 업체
SucroseMillipore SigmaS0389기타 다양한 공급 업체
TBSAlfa AesarJ62938기타 다양한 공급 업체
: TrisMillipore SigmaT1503기타 다양한 공급 업체
Tween-20FisherBP337-100기타 다양한 공급 업체
: Ubiquitin 항체Enzo 생명 과학BML-PW8810기타 다양한 공급 업체
합니다 : , , , , , , , , , , , , : , , : , , 기타 : , 만 , , , , , , , , , : , , , , : , , , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M.

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