방법 논문

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

DOI:

10.3791/59695

⸱

2019년 5월 21일

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 진핵생물의 단백질 분해 및 기타 다양한 세포 과정의 주요 조절제입니다. 뇌에서, 유비퀴틴-프로테아좀 활동의 증가는 시냅스 가소성 및 기억 형성에 매우 중요하며, 이 시스템의 비정상적인 변화는 다양한 신경학적, 퇴행성 및 정신 장애와 관련이 있다. 두뇌에 있는 기능을 유비퀴틴 proteasome 공부에 있는 문제점의 한가지는 단백질 표적, 기능적인 역할 및 규칙의 기계장치가 넓게 변화할 수 있는 모든 세포 구획에 존재한다는 것입니다. 그 결과, 동일한 동물 내의 다른 세포 내 구획에서 뇌 유비퀴틴 단백질 표적화 및 프로테아좀 촉매 활성을 직접 비교하는 능력은 UPS가 시냅스 가소성에 기여하는 방법을 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 기억력과 질병을 앓고 있습니다. 여기에 설명된 방법은 동일한 설치류(쥐) 뇌에서 핵, 세포질 및 조시냅스 분획을 수집한 다음 프로테아좀 촉매 활성의 동시 정량화(간접적으로 프로테아좀 코어의 활성 제공)를 허용합니다. 만) 및 링키지 특이적 유비퀴틴 단백질 태깅. 따라서, 이 방법은 시냅스 가소성, 기억 형성 및 상이한 질병 상태 동안 동일한 동물의 상이한 뇌 영역에서의 유비퀴틴-프로테아좀 활성의 세포내 변화를 직접 비교하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 동일한 동물 내의 다른 단백질의 세포내 분포 및 기능을 평가하는데 사용될 수 있다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 세포 1에서 대부분의 수명이 짧은 단백질의 분해를 제어하는 상호 연결된 단백질구조및 리가제의 복잡한 네트워크입니다. 이 시스템에서, 단백질은 작은 수정기 유비퀴틴에 의해 분해 또는 다른 세포 과정 / 운명에 대한 표시되어 있습니다. 표적 단백질은 7개의 리신(K) 부위(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63) 또는 이전 유비퀴틴 2에서 N-말단 메티오닌(M1; 선형으로 알려진) 중하나에서 함께 연결할 수 있는 1-7 유비퀴틴 변형을 획득할 수 있다. 이들 폴리비퀴틴 태그 중 일부는 분해 특이적(K48) 3이며, 다른 것들은 단백질 분해 과정(M1)4,5,6과크게 독립적이다. 따라서, 단백질 유비퀴틴화 과정은 믿을 수 없을 만큼 복잡하며 특정 폴리유비퀴틴 태그의 변화를 정량화하는 능력은 궁극적으로 세포 기능의 변형이 주어진 역할을 이해하는 데 매우 중요하다. 이 시스템의 연구를 더욱 복잡하게 하는, 프로테아좀은 UPS 7의 촉매구조인데, 둘 다 단백질을 저하시키지만 또한 다른 비단백질분해 과정에 관여할 수 있다8,9. 당연히 그 때, 그것의 처음 발견 부터, 정상 및 비정상적인 유비퀴틴-proteasome 활동은 많은 신경학상, 신경 퇴행성 및 정신병학을 포함하여 장기 기억 형성 및 각종 질병 국가에 연루되었습니다 장애10,11. 그 결과, 뇌에서 UPS 활동을 효과적이고 효율적으로 정량화할 수 있는 방법은 궁극적으로 이 시스템이 질병 상태에서 어떻게 dysregulated되는지 이해하고 유비퀴틴 및/또는 프로테아좀 기능.

쥐와 마우스에서 뇌 조직에서 유비퀴틴-프로테아솜 활성을 정량화하는 데 많은 문제가 있는데, 이는 1) 유비퀴틴 수정의 다양성, 및 2) 분포 및 세포 외 구획에 걸쳐 작동하는 UPS의 차동 조절12,13,14. 예를 들어, 기억 형성 동안 뇌에서 유비퀴틴-프로테아좀 기능의 초기 많은 데모는 전체 세포 용해및 단백질 유비퀴틴화 및 프로테아좀 활성 모두에서 시간 의존적 증가를 나타내었으며,15, 16세 , 17세 , 18세 , 19세 , 20. 그러나, 우리는 최근에 유비퀴틴 - proteasome 활동이 학습에 대한 응답으로 세포 외 구획에 걸쳐 광범위하게 변화한다는 것을 발견했으며, 일부 지역에서는 동시 증가와 다른 지역의 감소, 크게 다른 패턴이 있습니다. 이전에 전체 세포에서 보고 된 것에서21. 이것은 다른 세포 구획에 걸쳐 UPS 활동의 변화의 기여를 해리 할 수 없기 때문에 전체 세포 접근법의 한계와 일치합니다. 최근 연구는 학습에 대한 응답으로 시냅스에서 특히 UPS를 연구하기 위해 시냅스 분획 프로토콜을 채택했지만22,23,24,사용되는 방법은 측정 할 수있는 능력을 폐색 같은 동물에 핵 및 세포질 유비퀴틴 - 프로 테아좀 변화. 이로 인해 불필요한 실험을 여러 번 반복하여 각각다른 세포내 분획을 수집해야 합니다. 이것은 동물의 생명을 더 큰 손실귀착할 뿐 아니라, 주어진 사건에 응하여 다른 세포 외 구획에 걸쳐 UPS 활동을 직접 비교하는 기능을 제거하거나 특정 질병 상태 도중. 유비퀴틴과 프로테아좀의 단백질 표적이 세포 전체에 걸쳐 광범위하게 다르다는 점을 고려할 때, 유비퀴틴-프로테아좀 신호가 뚜렷한 세포외 구획에서 어떻게 다른지 이해하는 것은 UPS의 기능적 역할을 식별하는 데 매우 중요합니다. 기억 형성 및 신경 학 동안 뇌, 신경 퇴행 성 및 정신 장애.

이러한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 최근에 핵, 세포질 및 시냅스 분획이 동일한 동물21에서주어진 뇌 영역에 대해 수집 될 수있는 절차를 개발했습니다. 또한 동일한 샘플에서 여러 세포 외 분획을 수집하여 얻을 수 있는 제한된 양의 단백질을 고려하여 이전에 확립된 프로토콜을 최적화하여 시험관내 프로테아좀 활성 및 연계 성 활성을 분석했습니다. 설치류 뇌 조직에서 수집 된 lysed 세포에서 단백질 유비퀴틴. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 쥐의 측측 편도체에서 핵과 세포질및 시냅스에서 proteasome 활성, K48, K63, M1 및 전반적인 단백질 폴리유비퀴틴화 수준에서 학습 의존적 변화를 수집하고 직접 비교할 수 있었습니다. 여기에서는 UPS가 장기 기억 형성 및 다양한 질병 상태에 어떻게 관여하는지에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있는 절차(그림 1)를 자세히 설명합니다. 그러나, 당사의 프로토콜에서 논의된 시험관 내 프로테아솜 활성은 널리 사용되고 있지만, 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접적으로 측정하지 않는다는 점에 유의해야 한다. 오히려, 이 분석은 20S 코어의 활성을 측정하며, 이는 전체 26S 프로테아솜 컴플렉스와 는 반대로 코어 자체의 활동을 이해하는 프록시역할을 할 수 밖에 없다는 것을 의미합니다.

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프로토콜

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동물 과목을 포함한 모든 절차는 버지니아 폴리 테크닉 대학과 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 설치류 뇌 조직의 수집 및 해부

참고: 이 프로토콜은 다양한 뇌 영역에 적용될 수 있으며 다양한 조직 수집 절차와 함께 사용될 수 있습니다. 아래는 쥐 뇌 조직의 아세포에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하는 절차, 사용 하 여 8-9 주 오래 된 남성 Sprague Dawley 쥐. 동일한 동물의 모든 세포 구획을 처리하기 위해, 섹션 1.3. 사용된 조직 수집 절차에 관계없이 따라야 합니다.

  1. 쥐 의 뇌를 추출하고 드라이 아이스에 미리 차가운 극저온 컵에 배치합니다. 드라이 아이스에서 뇌를 플래시 동결하거나 가능한 경우 액체 질소를 사용하고 -80 °C 냉동고로 옮김을 사용하십시오. 뇌는 같은 날 또는 나중에 해부 될 수 있습니다.
  2. 극저온 컵에서 얼어 붙은 뇌를 제거하고 드라이 아이스로 차가운 쥐 뇌 매트릭스에 넣습니다. 행렬의 각 슬롯은 0.5mm에 해당하며, 관심 영역(ROI)의 대략적인 위치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
    1. 쥐 브레인 아틀라스를 사용하여 ROI의 예상 시작 바로 앞(앞쪽)에 면도날을 매트릭스에 삽입합니다. 다음으로 ROI의 예측 끝(후방)에 면도날을 즉시 삽입합니다.
    2. 메스를 사용하여 면도날 사이의 슬라이스를 제거하고 드라이 아이스에 차가운 현미경 슬라이드에 놓습니다. 일반적으로 섹션두께는 2-3mm이지만 ROI에 따라 다릅니다.
  3. 메스를 사용하여 ROI를 한 번에 한 반구로 해부합니다. 각 반구를 드라이 아이스에 미리 냉각된 별도의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다. 냉동 조직은 -80°C에서 보관하는 경우 세포내 분획을 즉시 사용하거나 나중에 처리될 수 있다.

2. 핵 및 세포질 추출

참고: 이 프로토콜은 0.1 M HEPES, 1 M MgCl 2,1 M 디티오트레이톨 (DTT), 0.5 M 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA), 5 M NaCl, 10 % NP-40 (IGEPAL) 및 50 % 글리세롤을 포함한 일반적인 실험실 화학 물질의 미리 만들어진 재고 솔루션을 사용합니다. 종점이 프로테아좀 활성 아세에 사용되는 경우, 글리세롤과 ATP는 용해 동안 프로테아좀 복합체의 분해를 방지하기 위해 모든 버퍼에 추가 될 수있다.

  1. Lysis 버퍼를 준비합니다. 멸균 된 15 mL 원엽 튜브에 8.63 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
    1. 원유관에 0.1 M HEPES 1,000 μL, 1M MgCl 15 μL, 1M DTT의 100 μL 및 10% NP-40의 50 μL을 추가합니다.
    2. 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL과 인산염 억제제 칵테일 100 μL을 넣습니다. 잠시 혼합하고 차가운 젖은 얼음에 배치하는 솔루션을 소용돌이. 상기 용액은 인산염 억제제로부터 황색 색조를 가질 수 있다.
      참고: 프로테아제 억제제의 사용은 단백질을 보존하고 시험관 내 프로테아좀 활성 분석법의 특이성을 보장하기 위해 필수적이다. 그러나, 이들 억제제는 또한 프로테아좀 활성의 경미한 감소를 초래할 수 있으며, 이는 시험관내 분석에서 측정된 활성이 실제 활성 수준의 과소평가일 수 있음을 의미한다.
  2. 추출 버퍼를 준비합니다. 멸균 된 15 mL 원엽 튜브에 5.925 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
    1. 원유관에 0.1 M HEPES 2,000 μL, 50% 글리세롤 1250 μL, 1 MMgCl 2, 1 M DTT의 5 μL, 0.5 M EDTA의 5 μL 및 5 M NaCl의 600 μL을 추가합니다.
    2. 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL과 인산염 억제제 칵테일 100 μL을 넣습니다. 잠시 혼합하고 차가운 젖은 얼음에 배치하는 솔루션을 소용돌이. 상기 용액은 인산염 억제제로부터 황색 색조를 가질 수 있다.
  3. -80°C 냉동고에서 ROI의 1반구를 포함하는 1.5 mL 원심분리기 마이크로튜브를 제거한다. 사용되는 반구가 각 실험 그룹에 대한 추출 조건에서 균형을 이루는지 확인합니다. 예를 들어, 2그룹 실험에서 각 그룹의 처음 두 동물에 대해 왼쪽 반구를 사용하고 다음 두 개의 샘플에 대해 오른쪽 반구를 사용합니다.
  4. 메스를 사용하여, 냉동 된 뇌 조직을 2 mL 유리 테플론 균질화로 옮김. 테프론 튜브에 500 μL의 Lysis 버퍼를 추가합니다.
    1. 유봉 B를 사용하여, 고체 물질의 눈에 보이는 양이 존재하지 않는 때까지 15 스트로크를 사용하여 동일한 조직을 균질화. 각 스트로크 중에 회전 모션(시계 방향 또는 시계 반대 방향)을 사용합니다.
  5. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 튜브를 젖은 얼음 위에 놓고 30 분 동안 배양하십시오.
  6. 미세 원심분리기에 튜브를 놓고 845 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 돌십시오. 완료 후, 조심스럽게 파이펫팅에 의해 상류를 제거하고 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 배치; 이것은 얼음 또는 섹션 2.9까지 4 °C에 저장할 수있는 세포질 분획입니다.
  7. 결과 펠릿에 추출 버퍼 50 μL을 추가하고 파이펫팅으로 다시 일시 중단합니다. 펠릿을 소용돌이하지 마십시오. 다시 매달린 펠릿을 함유한 튜브를 얼음 위에 놓고 30분 동안 배양한다.
  8. 튜브를 미세 원심분리기에 놓고 21,456 x g, 4 °C에서 20 분 동안 돌십시오. 완료 후, 조심스럽게 파이펫팅에 의해 상류를 제거하고 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 배치; 이것은 핵 분획입니다. 이제 펠릿을 버릴 수 있습니다.
  9. Dc 단백질 분석법(제조업체의 지침에 따라) 또는 비이온성 세제를 사용하여 수집된 샘플에 대한 동등한 분석법(이온성 분석법)을 사용하여 세포질 및 핵 추출의 단백질 농도를 측정합니다. 즉시 프로테아좀 활성 분석법(섹션 4) 또는 서양 블로팅(섹션 5)으로 진행합니다. 또는, 시료는 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있다.

3. 시냅스 분수 수집

참고: 이 프로토콜은 1M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA, 5 M NaCl 및 10 % SDS를 포함한 일반적인 실험실 화학 물질의 미리 만들어진 재고 솔루션을 사용합니다. 종점이 프로테아좀 활성 아세에 사용되는 경우, 글리세롤과 ATP는 용해 동안 프로테솜 복합체의 분해를 방지하기 위해 모든 버퍼에 추가 될 수있다

  1. 320 mM 자당으로 TEVP 버퍼를 준비합니다. 깨끗한 100 mL 비커에 60 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
    1. 비커에 1,300 μL의 1M Tris (pH 7.5), 0.5 M EDTA의 260 μL, 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL, 인산염 억제제 칵테일 100 μL 및 수크로오스 10.944 g을 추가합니다. 자당이 완전히 녹을 때까지 저어주면 됩니다.
    2. 피펫을 사용하여 용액에 염산(HCl)을 드롭와이즈로 첨가하여 pH를 ~7.4로 가져옵니다.
    3. 용액을 100mL 체적 플라스크로 옮김으로 옮니다. 초순수를 첨가하여 100 mL의 부피를 가져옵니다. 마지막 용액을 얼음에 식히고 필요할 때까지 식힙니다.
  2. 균질화 버퍼를 준비합니다. 깨끗한 100 mL 비커에 60 mL의 초순수 (탈이온화 및 증류) 물을 추가하십시오.
    1. 비커에 1 M Tris (pH 7.5), 3,000 μL 의 5 M NaCl, 프로테아제 억제제 칵테일 100 μL, 인산염 억제제 칵테일 100 μL 및 10 % SDS의 2,000 μL을 추가하십시오. 볶음막대와 섞으세요.
      참고: 이온성 세제는 프로테아좀 복합체의 변성으로 인해 프로테아좀 활성 검사를 방해할 수 있습니다. 원하는 경우 프로테아좀 기능을 보존하기 위해 SDS의 볼륨을 낮출 수 있습니다.
    2. 파이펫을 사용하여 용액에 HCl 드롭와이즈를 추가하여 pH를 ~7.4로 가져옵니다.
    3. 용액을 100mL 체적 플라스크로 옮김으로 옮니다. 초순수를 첨가하여 부피를 100mL로 가져옵니다. 최종 용액을 실온에 저장; SDS가 솔루션에서 침전되기 때문에 냉각되지 마십시오.
  3. -80°C 냉동고에서 ROI의 1반구를 포함하는 1.5 mL 원심분리기를 제거한다. 사용되는 반구가 각 실험 그룹에 대한 추출 조건에서 균형을 이루는지 확인합니다. 예를 들어, 2그룹 실험에서 각 그룹의 처음 두 동물에 대해 왼쪽 반구를 사용하고 다음 두 개의 샘플에 대해 오른쪽 반구를 사용합니다.
  4. 메스를 사용하여, 냉동 된 뇌 조직을 2 mL 유리 테플론 균질화로 옮김. 테프론 튜브에 TEVP 버퍼 500 μL을 추가합니다.
    1. 유봉 B를 사용하여 고체 물질의 눈에 보이는 전달이 없을 때까지 15 스트로크를 사용하여 동일한 조직을 균질화하십시오. 각 스트로크 중에 회전 모션(시계 방향 또는 시계 반대 방향)을 사용합니다.
  5. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 10 분, 4 °C에 대한 1,000 x g에서 샘플을 원심 분리.
  6. 상급체를 수집하고 1,000 μL 파이펫을 사용하여 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 10,000 x g에서 10 분, 4 °C의 샘플을 원심 분리합니다. 원래 펠릿 (P1)은 핵과 큰 파편을 포함하고 폐기 될 수있다.
  7. 상급체를 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 이것은 세포 분열분수입니다. 펠릿(P2)에 50 μL의 균질화 버퍼를 추가하고 고체 물질이 보이지 않을 때까지 파이펫팅하여 다시 중단합니다.
  8. 샘플을 20,000 x g에서 10 분, 4 °C로 원심 분리합니다. 상복부를 새로운 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮기고; 이것은 조시 냅 토 소 말 막 (시 냅 틱) 분획. 펠릿은 폐기할 수 있습니다.
  9. Dc 단백질 분석법(제조업체의 지침에 따라) 또는 이온 성 세제를 사용하여 수집된 샘플에 대한 동등한 분석법(이온 성 분획)을 사용하여 시냅스 분획의 단백질 농도를 측정합니다. 즉시 프로테아좀 활성 분석법(섹션 4) 또는 서양 블로팅(섹션 5)으로 진행합니다. 또는, 시료는 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있다.

4. 프로테아솜 활동 분석

참고: 프로테아솜 활성은 20S 프로테아솜 액티비티 키트의 약간 변형된 버전을 사용하여 균질화된 뇌 조직에서 측정될 수 있다. 이 분석은 완전한 26S 프로테아솜 복합체의 활성을 직접 측정하지 않는다. 오히려, 20S 코어의 활동을 측정, 그것은 단지 전체 26S proteasome 단지 반대로 코어 자체의 활동을 이해하는 프록시 역할을 할 수 있습니다 의미. 이 분석의 성공은 반복된 동결 해동 주기 및/또는 세제 의 증가 수준, 특히 이온성으로 감소하며, 360/460(여기/방출) 필터 설정 및 최대 37°C의 가열 기능을 갖춘 플레이트 리더기를 사용해야 합니다.

  1. 플레이트 리더 설정: 37°C로 미리 따뜻하게 하고 실행을 통해 유지합니다.
    1. 여기를 360으로 설정하고 방출을 460으로 설정합니다. 사용된 96웰 플레이트가 선명한 경우 광학 위치를 바닥으로 설정합니다. 다크/블랙 96 웰 플레이트를 사용하는 경우 광학 위치를 위로설정합니다.
    2. 형광 읽기 옵션에서 이전 플레이트 판독기 모델을 자동 게인으로 설정합니다. 최신 모델은 이를 위해 미리 설정되어 있습니다. 30분마다 2시간 동안 스캐닝(독서)하여 운동 실행을 프로그래밍합니다.
  2. 키트에 제공된 10x 분석 버퍼를 13.5 mL의 초순수로 재구성합니다. 100 mM ATP의 14 μL을 지금 1x 버퍼에 추가하십시오. 이것은 견본에 있는 proteasome 활동을 현저하게 향상하고 분석 결과 신뢰성을 향상시킵니다. 최종 20S 분석 버퍼는 필요할 때까지 얼음 또는 4 °C에 보관할 수 있으며 몇 개월 동안 안정적입니다.
  3. 키트에 제공된 AMC 표준을 100 μL의 DMSO로 재구성합니다. 표준이 빛에 민감하므로 어두운 환경에서 또는 저조도 조건에서 이 단계를 수행합니다.
  4. 어두운 환경에서 또는 저조도 조건에서 재구성된 표준을 사용하여 AMC의 스탠드 커브를 작성합니다.
    1. 별도의 0.5 mL 미세원원지 튜브에서 16, 8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 및 0 μL을 추가하여 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0 μM AMC 농도에 해당합니다.
    2. 이러한 튜브에 동일한 순서로 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 및 20S 분석 버퍼의 100 μL을 추가합니다. 이것은 균질화된 샘플에서 플레이트 판독기 보정 및 프로테아좀 활성의 분석에 사용될 일련의 높은 AMC 농도를 생성합니다.
    3. 희석된 모든 표준을 얼음에 보관하여 필요할 때까지 보관하십시오.
  5. 키트에 제공된 프로테아좀 기질(Suc-LLVY-AMC)을 65 μL의 DMSO로 재구성한다. 기판이 빛에 민감하기 때문에 어두운 또는 저조도 조건에서이 단계를 수행합니다. 20S 분석 버퍼를 사용하여 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 프로테아좀 기판의 1:20 희석을 생성합니다. 희석된 기판을 얼음에 보관하여 필요할 때까지 보관하십시오.
    참고: 예를 들어, 플레이트에 10개의 샘플과 1개의 공백이 있는 경우, 웰당 10 μL에서 22개의 웰(중복)에 대해 충분한 희석기판이 필요합니다. 이는 파이펫팅 오류에 대해 220 μL + 30 μL이 필요하며, 기판12.5 μL과 20S 분석 버퍼의 237.5 μL이 필요합니다.
  6. 원하는 시료를 해동(냉동된 경우)하고 정규화된 양을 96웰 플레이트에 첨가합니다. 중복으로 각 샘플을 실행합니다. 필요한 견본의 양은 조직 준비에 따라 변화합니다. 일반적으로 10-20 μg는 모든 세포내 분획에 충분합니다.
  7. 초순수로 샘플을 80 μL로 잘 채량합니다. 추가된 양은 추가된 샘플의 부피에 따라 다릅니다. 예를 들어, 샘플 1이 단백질의 4.5 μL이고 샘플 2가 8.7 μL인 경우, 필요한 물의 양은 각각 75.5 μL 및 71.3 μL이 될 것이다. 두 개의 별도 우물에서 80 μL의 물을 단독으로 추가하십시오. 이들은 분석 공백이 될 것입니다.
    참고: 파이펫팅 오류로 인한 단백질 부피의 변화를 제한하기 위해 단백질 농도는 가장 적은 농축 시료로 정규화될 수 있습니다. 이렇게 하면 모든 조건에서 동일한 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다.
  8. 분석 공백을 포함하여 각 우물에 20S 분석 버퍼의 10 μL을 추가합니다. 유정 전반에 걸쳐 일관된 분석 부피를 보장하기 위해 리피터/자동 파이펫을 권장합니다.
  9. 선택 사항: 이 단계에서, 원하는 경우 시험관 내 조작을 소개; 이를 위해서는 각 샘플에 차량을 포함한 치료당 2개의 웰이 추가로 필요합니다. 그렇다면, 5-10 μL의 약물/화합물을 샘플 웰 2개에 추가하고 다른 2개의 웰에 동등한 양의 제어/차량을 추가하십시오. 플레이트를 예온 된 플레이트 리더에 놓거나 37 °C 인큐베이터에 30 분 동안 놓습니다.
  10. 조명을 끄거나 어두운 방에 들어갑니다. 희석 된 AMC 표준 의 모든 100 μL을 새로운 우물에 추가하십시오. 각 표준은 하나의 우물을 해야합니다.
  11. 어둠 속에서, 샘플과 분석 공백을 포함하는 우물에 희석 된 프로 테아좀 기판 10 μL을 추가하지만 AMC 표준에는 넣지 않습니다. 유정 전반에 걸쳐 일관된 분석 부피를 보장하기 위해 리피터/자동 파이펫을 권장합니다.
  12. 플레이트를 플레이트 판독기에 넣고 운동 실행을 시작합니다.
    참고: 플레이트는 운동 실행 중에 일정한 교반하에 있을 필요가 없지만 원하는 경우 사용자가 선택할 수 있습니다.
  13. 운동 실행이 끝나면 원시 형광 값 360/460을 Microsoft Excel로 내보냅니다.
    1. 각 표준, 각 샘플 및 5개 스캔 모두에 대해 분석 공백에 대해 함께 중복 된 우물을 평균화합니다. 원시 형광 값은 샘플에 대한 스캔을 통해 증가해야하지만 표준 및 분석 공백에 대한 안정 (또는 약간 감소).
    2. 가장 높은 AMC 표준을 잘 평균하고 공지된 농도(20 μM)로 나눈다. 표준화된 AMC 값을 얻기 위해 분석에서 사용되는 샘플 농도로 이 값을 나눈다. 각 샘플 및 분석 빈 평균에 대해 표준화된 AMC 값으로 나눕니다.
    3. 이 최종 값을 취하여 분석에서 사용된 표본 농도로 나누어 각 샘플과 분석 빈에 대한 정규화된 값을 얻습니다. 모든 5 스캔에 대해이 작업을 수행합니다.
    4. 모든 5개의 검사에 대해 정규화된 각 샘플 값에서 정규화된 분석 빈 값을 뺍니다.

5. 링키지 특이적 단백질 유비퀴틴화의 정량화

  1. 설치류 뇌 조직에서 수집 된 다른 세포 분열에서 다양한 폴리 유비 퀴틴 태그의 정량화는 독특한, 링크주 특이적 폴리 유비퀴틴 항체와 함께 다양한 표준 서양 블로팅 프로토콜을 사용하여 수행해야합니다.
    1. 변성의 경우, 정규화된 샘플을 β-메르카포에탄올로 보충한 동일한 부피의 Laemmli 샘플 버퍼와 혼합하여 제조업체의 지시에 따라 부피 5%의 백분율로 혼합합니다.
    2. 링키지에 관계없이 모든 단일 유큐퀴틴화 및 폴리유비퀴틴화 변형의 정량화를 위해 범유비퀴틴 항체를 사용하십시오.
    3. 모든 폴리비퀴틴화 단백질을 인식하려면 단큐퀴틴화와 교차 반응하지 않는 유비퀴틴 항체를 사용하십시오.
    4. 링키지 특이적 폴리유퀴틴화의 경우, 리신-27, 리신-48, 리신-63 및 선형(M1) 폴리유비퀴틴화를 검출할 수 있는 항체를 사용한다.
  2. 거짓 양성을 초래하거나 다른 유비퀴틴 변형의 이미징을 방해할 수 있는 개발 간의 교차 오염을 방지하기 위해, 10 분 동안 0.1 M NaOH를 사용하여 개발 사이의 스트립 멤브레인.
    1. 10 분 동안 0.1 % 트위넨으로 TBS에서 멤브레인을 두 번 씻고 다시 차단하십시오 (사용되는 웨스턴 블롯 프로토콜에서 선호되는 차단제를 사용).
    2. 이차 항체와 멤브레인을 배양하고 멤브레인이 1 차 및 이차 항체를 제대로 벗겨졌는지 확인하기 위해 재개발합니다.
    3. 권장 사항: 오염없이 다른 유비퀴틴 항체의 성공적인 개발을 위해 형광 또는 근적외선 이미징 시스템을 사용하십시오. 이것은 수시로 항체 사이 이월을 방지할 수 있습니다.
  3. 일부 유비퀴틴 웨스턴 블롯 이미지는 뚜렷한 밴드(예: M1)의 열을 제공하는 반면, 다른 이미지는 명확한 선이 거의 없거나 전혀 없는 얼룩 모양의 패턴을 생성합니다(K48과 공통). 이미지 유비퀴틴 웨스턴 블롯의 정량화를 위해 전체 분자 표준 사다리를 확장하는 기둥 주위에 상자를 그립니다.
    1. 유비퀴틴 염색이 전체 사다리를 통과하는 경우 상자를 위(또는 아래로) 조정합니다. 이것은 Lysine-48 수정에 대 한 일반적 이며 세포 외 구획에 걸쳐 광범위 하 게 변화.
    2. 모든 면에서 열을 둘러싼 배경의 평균 광학 밀도로 계산되는 배경을 뺍니다.

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결과

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여기에 기재된 절차를 사용하여, 핵, 세포질 및 시냅스 분획을 쥐 뇌의 측측편도체로부터 수집하였다(도 1). 개별 분획의 순도는 서쪽 블로팅을 통해 확인되었고, 리세이트에서 농축되거나 고갈되어야 하는 단백질에 대한 항체를 조사했다. 조시냅스 분획이 수집된 제1 반구에서, 후층성 밀도 단백질 95(PSD95)는 세포질에서 더 낮은 수준으로 시냅스,분획이 아닌 시냅스에 존재하였다(도 2A). 이는 시냅스 분획 제제가 시냅스 전 및 후성 내피 성분둘다를 분리한다는 것을 입증하는 이전 작업과 일치한다(25). 반대로, 핵 단백질 히스톤 H3는 핵에 존재하였으나 시냅스, 분획, 세포질에서 더낮은 수준으로 존재하였다(도 2B). 세포질에서 PSD95 및 H3의 존재는 세포질 번역과...

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토론

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여기에서, 우리는 동일 동물에 있는 다른 세포 내 구획에 걸쳐 유비퀴틴-proteasome 활동의 변경을 정량화하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 현재, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 활성에서 세포외 변화를 측정하는 대부분의 시도는 샘플당 단일 구획으로 제한되어 실험을 반복할 필요가 있다. 이것은 상당한 비용과 동물의 생명의 손실로 이어집니다. 우리의 프로토콜은 반구를 분할하여이 문제를 완화, 다른 세포 분획은 동일한 동물의 각 반구에서 수집 할 수 있도록. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 학습21에응하여 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 동일한 동물 유비퀴틴-프로테아좀 활성이 분별적으로 변화한다는 것을 처음으로 보여줄 수 있었다.

여기서 설명된 프로토콜의 주요 제한사항은 수득된 뇌 조직(샘플)의 양에 의존한다. 예를 들어, 위에서 설명한 대로 이 프로토콜은 주어진 뇌 영역의 반구를 분할해야 합니다. 그러나 한 반구에만 존재하는 특정 영역의 ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 농업 및 생명 과학 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다 버지니아 공대에서 과학 대학. T.M.는 버지니아 공대의 조지 워싱턴 카버 프로그램에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M EDTAFisher15575020다양한 기타 공급 업체
20S 프로테아솜 활성 키트Millipore SigmaAPT280기타 공급 업체는 다른 버전을 제공합니다
ATPFisherFERR1441다양한 기타 공급 업체
베타 액틴 항체세포 신호4967S다양한 기타 공급 업체
베타 튜불린 항체세포 신호2128T다양한 기타 공급 업체
BioTek Synergy H1 플레이트 리더BioTekVATECHH1MT3기타 공급 업체는 다른 버전을 운반
B-mercaptoethanolFisherICN19024280다양한 기타 공급 업체
Clasto lactacystin b-lactoneMillipore SigmaL7035기타 다양한 공급 업체
극저온 컵Fisher033377B다양한 기타 공급 업체
DMSO DMSOD8418다양한 기타 공급 업체
DTTMillipore SigmaD0632다양한 기타 공급 업체
GlycerolMillipore SigmaG5516다양한 기타 공급 업체
H3 항체Abcam ab1791다양한 기타 공급 업체
HEPESMillipore SigmaH3375다양한 기타 공급 업체
염산FisherSA48기타 다양한 공급업체
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021기타 다양한 공급업체
K48, Ubiquitin 항체Abcamab140601기타 다양한 공급업체
K63, Ubiquitin 항체Abcamab179434기타 다양한 공급업체
KClMillipore SigmaP9541다양한 기타 공급업체
KONTES 조직 분쇄기VWRKT885300-0002다양한 기타 공급업체
Laemmli 샘플 버퍼Bio-rad,161-0737다양한 공급업체
선형 유비퀴틴 항체수명 센서AB-0130-0100M1 항체
MgClMillipore, 시그마442611기타 다양한 공급업체
마이크로 원심분리기Eppendorf2231000213다양한 기타 제조업체/모델
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500Carried by Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014다양한 기타 공급업체
Odyssey Fc Imaging SystemLiCor2800-02기타 공급업체는 다른 버전을 제공합니다
Phosphatase InhibitorMillipore Sigma524625다양한 기타 공급업체
: Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373다양한 기타 공급업체
프로테아제 억제제Millipore SigmaP8340다양한 기타 공급업체
PSD95 항체세포 신호 3450T다양한 기타 공급업체
, SDS,Millipore SigmaL3771다양한 기타 공급업체
: 수산화나트륨FisherSS255기타 다양한 공급 업체
SucroseMillipore SigmaS0389기타 다양한 공급 업체
TBSAlfa AesarJ62938기타 다양한 공급 업체
: TrisMillipore SigmaT1503기타 다양한 공급 업체
Tween-20FisherBP337-100기타 다양한 공급 업체
: Ubiquitin 항체Enzo 생명 과학BML-PW8810기타 다양한 공급 업체
합니다 : , , , , , , , , , , , , : , , : , , 기타 : , 만 , , , , , , , , , : , , , , : , , , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115(2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349(2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

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