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방법 논문

원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

7.3K 조회수

DOI:

10.3791/59704

2019년 6월 5일

이 논문에서

요약

우리는 원뿔 판 점도를 사용 하 여 혈소판 표면 수용 체에 균일 한 전단을 적용 하는 인 솔루션 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 다른 세포 유형 및 세포 단편에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍을 표적으로 할 필요가 없는 더 광범위 하 게 사용 될 수 있다.

초록

많은 생물학 세포/조직은 기계 수용 체를 통해 그들의 현지 환경의 기계적인 속성을, 압력 또는 기계적인 섭 동 같은 힘에 반응할 수 있는 단백질을 감지 합니다. 기계 수용 체는 자극을 감지 하 고 다양 한 메커니즘을 통해 신호를 전송 합니다. 기계 수용 체에 대 한 가장 일반적인 역할 중 일부는 신경 반응에, 터치와 통증 같은, 또는 균형 및 청각에서 기능 하는 머리 세포. 기계 감각은 또한 정기적으로 혈관 내 피 세포와 같은 전단 응력에 노출 되는 세포 종류에 대 한 중요 한, 어떤 라인 혈액 혈관, 또는 정상적인 순환에 전단을 경험 하는 혈액 세포. 점도 계는 유체의 점도를 감지 하는 장치입니다. 회전 점도 계는 또한 유체에 공지 된 전단 력을 적용 하기 위해 사용 될 수 있다. 유체에 균일 한 전단을 소개 하는이 계기의 능력은 혈액과 플라스마를 포함 하 여 많은 생물학 액체를 연구 하기 위하여 착취 되었습니다. 점도는 또한 용액 내의 세포에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍에 전단의 영향을 시험 하기 위해 사용 될 수 있다. 여기에서, 우리는 콘 플레이트 점도 혈소판 기계 감각 수용 체 복잡 한 GPIb에 대하여 항 체로 처리 한 혈소판에 전단 응력의 내 인 성 수준의 효력을 시험 하기 위하여 이용 합니다.

서론

기계 수용 체는 압력 또는 기계적인 섭 동/변형과 같은 기계적인 자극에 반응 하는 단백질입니다. 일부 기계 수용 체의 경우, 이러한 기계적 섭 동을 감지 하는 것은 그들이 발현 되는 세포 유형의 기능에 명시 적 이다. 복용, 예를 들어, baroreceptor 뉴런의 스트레칭 수용 체; 이러한 기계 과민 이온 채널은 혈관 "스트레칭"1,2를 감지 하 여 혈압을 조절 합니다. 내이에서 머리카락 세포의 이온 채널은 음파3으로 인 한 기계적 변형을 감지 하 고 피부 낮은 임계 기계 수용 체 (ltmrs)는 촉각 정보4의 전달을 용이 하 게 합니다. 다른 경우에, 기계 수용 체는 접착 또는 성장의 설치를 위해 세포에 중요 한 정보를 제공 합니다. 세포는 그들의 국부 환경의 강성을 감지할 수 있고, 성장 또는5확산을 지시 하는 액 틴 세포 골격 및 인 테 그린을 통해 수축 힘에 의존할 수 있다.

세포 또는 조직 기반 모델에서 수용 체-리간드 상호 작용을 연구 ....

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프로토콜

본 원에 기재 된 기증자 유래 인간 혈소판을 사용 하는 모든 방법은에 모리 대학교/아 틀 란 타의 어린이 건강 관리 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 혈액 채취 및 혈소판 분리

  1. 실험 당일에에 동의 건강 한 성인 기증자를 통해 인간의 혈액을 그립니다 3.8% 트리 구 연산 나트륨. 혈액의 1 개의 4.5 mL 관은 혈소판이 1 μ l 당 250 x 10에 가까운 기증자에 있는 20-25 조건에 대 한 충분 한 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 산출 하기 위하여 충분 합니다.
    참고: 좁은 게이지 바늘 (21G 보다 작음)을 통해 혈액을 채취 하지 마십시오.
  2. 22 ° c에서의 원심 분리를 통해 PRP를 준비 하 고, 긴 브레이크로 12 분 동안 140 x g . 이것은 두 개의 별개의 층으로 이어질 것입니다, 아래에 적혈구와 상단에 밝은 색깔의 PRP.
  3. 45 ° 각도로 절단 된 피 펫 팁을 통해 신중한 파이 펫 팅을 통해 PRP의 위, 흐린, 노란 층을 분리 하 고 완전 한 혈 수 (CBC)를 통해 혈소판 수를 얻습니다.
  4. 필요한 경우에는 파이프에서 혈소판을 세척 하 고, 2.9 0.34 134 Tyrode의 프로 스타 글란 딘 E....

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결과

도 1 은 상기 혈관 벽에 앵커 되었을 때 전단 의존적 수용 체 활성화를 설명 하기 위해 처음 도입 된 GPIB-IX 활성화의 트리거 모델을 개략적으로 설명 하 고, 또한 다가 리간드에 의해 가교 된 혈소판의 활성화를 지원할 수 있다. 도 2 는 GPIB-IX (6B4 및 11A8)의 N-말단 도메인을 표적화 하 고 전단 및 정적 조건 하에서 하나의 대조 항 체 (정상 IgG)를 대상으로 하는 2 개의 항 체에 의해 처리 된 인간 혈소판 활성화의 판독을 보여준다. 도 3에서, 혈소판은 6b4 및 비 결합 력이 지나치게 낮은 항 체로 처리 하 여 GPIB-IX 활성화를 AK2. 그림 4 에는 시간 코스가 나와 있습니다. 혈소판 활성화의 마커는 11A8 또는 AK2로 전단 처리 시 진보적인 시점에서 프로브 및 검출 되었다.......

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토론

이 원고에 설명 된 프로토콜은 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 층 류 전단 효과의 신속 하 고 다양 한 평가를 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 특정 대표적인 결과는 다이 성체 또는이가 리간드의 영향이 전단 흐름에 의해 영향을 받을 수 있는 방법을 강조 한다. 이 응용 분야 외에도 균일 한 전단 분석은 전단 의존적 효과를 관찰 하는 광범위 한 응용 분야를가지고 있습니다. 알려진 리간드-수용 체 쌍의 부재 하에서, 균일 한 전단 분석은 또한 특히 유 세포 분석 분석과 쌍을 이루는 경우 세포 형태 및 신호와 같은 요인에 대 한 전단의 영향을 검출할 수 있습니다. 그림 5b에 의해 부분적으로 언급 되는 균일 한 전단 분석은 이미징, 생화학 및 세포 기반을 포함 하 여이 프로토콜에 설명 된 표준 유 세포 측정 분석을 보완 하는 것 이외의 다양 한 검출 방법에 적합 합니다. 분석.

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구에 관련 된 작업은 국가 보건 연구소 (NIH) 국립 심장, 폐 및 혈액 학회 보조금 HL082808, HL123984 (R.L.) 및 F31HL134241 (M.E.Q.)에 의해 부분적으로 지원 되었습니다. 자금 조달은 또한 NIH 국립 연구소 일반 의료 과학 교부 금 T32GM008367 (M.E.Q.)에 의해 제공; 애 틀 란 타 및에 모리 대학교 소아과 유 세포 분석 코어의 아동 건강 관리에서 파일럿 보조금을 지급 합니다. 저자는 6B4 항 체를 공유 하는 Dr. Hans Deckmyn과 기술 지원을 위한 Emory 아 이들의 소아과 연구 센터 유 세포 분석 코어를 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
APC anti-human CD62P (P-Selectin)BioLegend304910
Brookfield Cap 2000+ 점도계
Erythrina cristagalli lectin (ECL)Vector LabsFL-1141
Pooled Normal Human PlasmaPrecision BiologicCCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)BD369714
Vacutainer 혈액 채취 세트, 21G x ¾ " 니들BD367287
Brookfield-FITC-conjugated

참고문헌

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Sing....

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재인쇄 및 허가

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