여기서 설명된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다.
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이 논문에서
요약
초록
인간의 장내 미생물은 최근 인간의 건강을 증진하고 질병을 예방하는 연구의 중요한 대상이되었습니다. 따라서, endobiotics 사이 상호 작용의 조사 (예를 들어, 마약과 prebiotics) 그리고 창 자 microbiota 중요 한 연구 주제가 되고있다. 그러나, 인간 자원 봉사자와 생체 내 실험은 생물 윤리 및 경제적 제약으로 인해 이러한 연구에 이상적이지 않습니다. 그 결과, 동물 모델은 생체 내에서 이러한 상호작용을 평가하는 데 사용되어 왔다. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델 연구는 여전히 생물 윤리 고려에 의해 제한 됩니다., 동물 대 인간에서 microbiota의 다른 조성및 다양 성 뿐만 아니라. 대체 연구 전략은 시험관내 내생생물학과 장내 미생물 간의 상호 작용을 평가할 수 있는 일괄 발효 실험의 사용입니다. 이러한 전략을 평가하기 위해, 비피도박테리아(Bif) 외다당류(EPS)를 대표적인 제노바이오틱으로 사용하였다. 그 후, Bif EPS와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은 16S rRNA 유전자고 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피와 같은 얇은 층 크로마토그래피(TLC), 세균 공동체 조성 분석과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 조사되었습니다. 짧은 사슬 지방산 (SCFA)의. 여기에 제시된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다. 중요 한 것은, 이 프로토콜은 또한 다른 endobiotics와 창 자 microbiota 사이 일반적인 상호 작용을 조사 하기 위해 수정될 수 있습니다.
서론
창자 미생물은 인간의 창자 기능과 숙주 건강에 중요한 역할을 합니다. 따라서, 창자 미생물은 최근 질병 예방 및 치료1의중요한 표적이되었습니다. 또한, 창 자 박테리아 호스트 장 세포와 상호 작용 하 고 기본적인 호스트 프로세스를 조절, 신진 대사 활동을포함 하 여, 영양소 가용성, 면역 체계 변조, 심지어 뇌 기능 및 의사 결정 2,3 . Endobiotics 세균 성 구성 및 창 자 microbiota의 다양성에 영향을 미칠 상당한 잠재력을 가지고. 따라서, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은4,5,6,7,8,9.
생체 윤리 및 경제적 제약으로 인해 생체 내 내 생물 학 및 인간의 창 자 microbiota 사이의 상호 작용을 평가 ....
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프로토콜
이 프로토콜은 후난 과학 공학 대학 (후난, 중국) 및 절강 공샹 대학 (절강, 중국)의 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 박테리아의 준비
- 비피도박테리움 배지 국물의 제조
- 950 mL의 증류수에 다음 구성 요소를 결합하십시오 : 고기 추출물, 5 g / L; 효모 추출물, 5 g / L; 카제인 펩톤, 10 g/L; 콩톤, 5 g / L; 포도당, 10 g/L; K2HPO4,2.04 g/L; MgSO4·7H 2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; NaCl, 5 g/L; 트웬 80, 1 mL; 소금 용액, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g / L; KH2PO4,1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); 및 resazurin, 0.4 mL (2.5 mg /L). 2 M NaOH로 pH를 6.8로 조정합니다.
- 121°C에서 15분간 오토클레이브하고 국물을 혐기성 조건하에서 실온(RT)으로 냉각시키십시오(10% H2,<....
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결과
점막 EPS의 생산은 72 시간 동안 혐기성 배양 후 PYG 플레이트에 대한 B. longum 배양물에서 관찰 될 수있다 (도1A). 배양 스크레이프의 원심분리, 에탄올 침전 및 건조에 이어, 셀룰로오스유사 EPS의수집을 초래하였다(도 1B). 건조된 EPS 및 수용성 전분은 발효 배양용 탄소 공급원으로 사용되었습니다. TLC는 낮은 비용과 신속한 결과 턴어라운드로 인해 올리고당 분리 및 순도 분석에 사용되었다18. 인간 배설물 미생물에 의한 전분의 분해 속도는 Bif EPS(그림2)보다 빠르지만, 일부 EPS 접종 샘플에 대해 Bif EPS 분해가 명확하게 관찰되었다.
16S rRNA 유전자를 통한 커뮤니티 조성 분석 고처리량 시퀀싱 및 주요 좌표 분석(PCoA.......
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토론
지난 10년 동안 인간의 장내 미생물 구성과 활동을 이해하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 이러한 연구의 결과로, 홀로비오온 개념은 인간과 그들의 창자 microbiota 사이와 같은 호스트와 관련미생물 군사회사이 상호 작용을 나타내는 19,20. 더욱이, 인간은 지금도 초고생물(21)으로 여겨지고 있으며, 여기서 장내 미생물은 인간22,23에서기능성 기관 중 하나로 인식되고 있다. 인체는 약 10 개의13 미생물 세포(24)로구성된 복잡한 미생물 생태계를 호스팅합니다. 더욱이, 장내 미생물의 게놈은 호스트의 대사 능력을 확장하는 수많은 대사 관련 유전자를 인코딩하는인간으로부.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다. 수치는 Yin 외에서 인용되었다. 11.
감사의 글
이 연구는 중국 국립자연과학재단(31741109호), 후난자연과학재단(2018JJ3200호), 후난대학교 과학공학부 에서 의뢰한 특성분야 조성 프로그램이다. 이 원고를 준비하는 동안 LetPub (www.letpub.com)의 언어 적 지원에 감사드립니다.
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재료
4
브 매체 베이킹 오븐 쇠고기 추출물 Solarbio G8270을 표준 샘플의 구성 요소 담즙 염 Solarbio C7250 의 구성 요소 < 매체 의 구성 요소 중간 의 구성 요소 중간 의 구성 요소피에 사용 용 표준 샘플 매체 의 염 용액의 매체 LnSO 매체 기서열 분석의 B7350 표준 샘플 매체 의 구성 요소 용 표준 샘플 제조하는 데 사용 매체
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; m 멤브레인 필터 | Millipore | SLGP033RB | 샘플 필터링에 사용 |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | 인간 배설물 샘플 준비에 사용 |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | 컬러 플레이트 준비에 사용 |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | SCFA 한천용 표준 샘플 |
| Solarbio | YZ-1012214 | ||
| 매체 혐기성 챔버 | Electrotek의 구성 요소 | AW 400SG | 박테리아 배양 및 발효 |
| 오토클레이 | SANYO | MLS-3750 | |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | 의 구성 요소 |
| Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | 가열하고 굽는 데 사용 | |
| 매체의 구성 요소 | |||
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | 박테리아 |
| 담즙 염 | Solarbio | YZ-1071304 | |
| SCFA | |||
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | 소금 용액 용 |
| SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μ m) | SCFA 검출에 사용 | |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | 중간 |
| 원심분리기 | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | 원심분리에 사용 |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | 중간 CuSO의 구성 요소 |
| sub>4.5H2O | Solarbio | 203165 | |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | |
| 에탄올 | Sigma-Aldrich | E7023 | 비타민 K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | |
| 포름산 | Sigma-Aldrich | 399388 | TLC |
| 가스 크로마토 그래 | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | SCFA 검출에 사용 |
| 유리 비커 | Fisher Scientific | FB10050 | 슬러리 준비에 사용 |
| 포도당 | Solarbio | G8760 | 매체의 구성 요소 |
| Haemin | Solarbio | H8130 | 매체의 구성 요소 |
| HCl | 의 구성 요소Sigma-Aldrich | 30721 | 완충액의 pH를 조정하는 데 사용되는 기본 용액 |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | SCFA |
| 이소발레르산 | Sigma-Aldrich | 129542 | SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | |
| KCl | Solarbio | P9921 | 매체 |
| KH2PO4 | Solarbio | 성분 P7392 | 매체 |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | 컬러 플레이트 고기 추출물 제조에 사용 |
| Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | ||
| 메타인산 | Sigma-Aldrich | 의 성분 | SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | 매체 |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | 염 용액 |
| Illumina | MiSeq 300PE 시스템 | DNA 염 | |
| . H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | 매체 |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | 항생제 |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | 매체 |
| NaHCO의 소금 용액3 | Sigma-Aldrich | 792519 | 매체 |
| NanoDrop ND-2000 | 소금 용액 NanoDrop Technologies | ND-2000 | DNA 농도 결정 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | 완충액의 pH를 조정하는 데 사용되는 염기성 용액 |
| n-부탄올 | ChemSpider | 71-36-3 | TLC |
| NiCl2< | /sub>Solarbio | 746460 | |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | 오르시놀 시약을 |
| 제조하는 데 사용됩니다.Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | SCFA |
| QIAamp DNA 대변 미니 키트 | QIAGEN | 51504 | 추출물 박테리아 게놈 DNA |
| 즉시 사용 가능한 PBS 분말 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | 지질 현탁액을 제조하는 데 사용 |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | 혐기성 장비 |
| 속도 진공 농축기 | LABCONCO | CentriVap | EPS 전분 제조에 사용 |
| Solarbio | YZ-140602 | 탄소원 사용 | |
| 황산 | Sigma-Aldrich | 150692 | 오르시놀 시약을 |
| T100 PCR | BIO-RAD 1861096 | PCR 증폭 | |
| TLC 알루미늄 시트 | MerckMillipore | 116835 | TLC |
| Trypticase 펩톤 | 시그마-알드리치 | Z699209 | 매체 |
| 트립톤 | 시그마-알드리치 | T7293 | 매체의 성분 |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | 매체의 소금 용액 |
| 발레릭 | 시그마-알드리치 | 75054 | SCFA |
| 비타민 K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | 표준 샘플 매체 |
| 와류 발진기 | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | 사용 |
| 효모 추출물 | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| ZnSO4.7H의 구성 요소2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | 매체의 구성 요소 |
참고문헌
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....
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