방법 논문

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

DOI:

10.3791/59733

⸱

2019년 7월 19일

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

초록

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수많은 세포내 단백질은 세포내 및 세포외 상황에 따라 물리적으로 상호 작용합니다. 실제로, 세포 기능은 주로 세포 내 단백질-단백질 상호 작용에 따라 달라 집니다. 따라서, 이러한 상호 작용에 관한 연구는 생리 적 프로세스의 이해를 촉진 하는 데 필수적이다. 질량 분석법 (MS) 분석에 선행된 관련 단백질의 공동 침전은, 새로운 단백질 상호 작용의 확인을 가능하게 합니다. 이 연구에서는, 우리는 단백질-단백질 상호 작용의 분석을 위한 온 막 소화와 결합된 면역 침전 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 분석의 새로운 기술의 세부사항을 제공했습니다. 이 기술은 원유 면역 침전제에 적합하며 단백질 분석의 처리량을 향상시킬 수 있습니다. 태그가 지정된 재조합 단백질은 특이적 항체를 사용하여 침전되었고; 다음으로, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 조각에 블린된 면역침전제는 환원 알킬화를 행하였다. 트립시니화 후, 소화된 단백질 잔기를 LC-MS/MS를 사용하여 분석하였고, 이 기술을 사용하여, 우리는 여러 후보 관련 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 이 방법은 새로운 단백질-단백질 상호작용의 특성화에 편리하고 유용하다.

서론

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단백질은 살아있는 유기체에서 구성적인 역할을 하지만, 세포 내 환경에서 지속적으로 합성, 처리 및 저하됩니다. 더욱이, 세포내 단백질은 자주 물리적으로 그리고 생화학적으로 상호 작용하며, 이는 하나 또는 둘 다의 기능에 영향을 미치는 1,2,3. 예를 들어, 진핵 번역 개시 인자 4A3(eIF4A3)과 스플리케오솜 관련 단백질 상동체 CWC22의 직접 결합은 엑소온 접합 복합체4의조립에 필요하다. 이와 일치하여, CWC22에 대한 친화력이 결여된 eIF4A3 돌연변이체는 엑온 접합복합체 구동 mRNA 접합을 용이하게 하지 못한다 4. 따라서, 단백질 상호 작용의 연구는 세포 기능뿐만 아니라 생리학적 조절의 정확한 이해를 위해 중요합니다.

질량 분석법 (MS)에 있는 최근 어드밴스는 단백질 단백질 상호 작용의 포괄적인 분석에 적용되었습니다. 예를 들어, 내인성 단백질의 공동 침전 또는 외인성 으로 그들의 관련 단백질과 함께 태그가 부착된 단백질을 도입하고, MS 분석에 이어, 새로운 단백질 상호작용의 식별을 가능하게한다5. 그러나, MS/MS 분석의 한 주요 병목 현상은 단백질 샘플의 tryptic 소화에서 가난한 복구. 세포 용해제에 대한 단백질 분석을 수행하기 위해, 인젤 및 온 막 소화 기술은 일반적으로 MS / MS 샘플을 준비하기 위해 사용됩니다. 우리는 이전에 온 막 소화 기술 6와 인 젤 소화절차를 비교하고, 후자는 더 나은 서열 범위와 연관되었다는 것을 보여주었습니다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인은 유기 용제7,8의고농도에 기계적으로 견고하고 내성이 있기 때문에 이러한 목적에 적합할 수 있으며, 고정화의 효소 소화를 허용한다. 80 % 아세토니트릴 9의존재에 단백질 . 더욱이, 막에 고정화는 표적 단백질에 있는 형태 변경을 유도할 수 있고, 시도소화 효율에 있는 개선으로 이끌어 내는10. 따라서, 이 문서에서는, 우리는 온 막 소화 기술을 사용하여 단백질 상호 작용의 면역 침전-LC/MS/MS 분석의 사용을 기술했습니다. 이 간단한 방법은 비 전문 실험실에서도 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하게 합니다.

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프로토콜

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1. 면역 침전

참고: 우리는 다음 섹션에 설명된 바와 같이 비 나트륨 도데실 황산염 (SDS) 용해 완충및 구연산염 용출을 사용했습니다. 그러나, 대안적인 사내 면역침전 기술의 사용은 LC-MS/MS 샘플을 준비하기 위해 또한 적용될 수 있다.

  1. 에피토프 태그 단독 또는 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 가진 트랜스펙트 배양 세포. 대표적인 데이터를 획득하기 위해, G774 세포(1 x 10 6)를 양이온 리포좀을 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP) 단독으로 또는 GFP 융합 Capn6(calpain-6 gene)을 코딩하는 벡터로 전송합니다.
  2. 자기 구슬에 대한 항체를 융합합니다.
    1. 이를 위해, 1.5 mL 시험관에서 500 μL의 구연산 인산완충액(24.5mMMM, 51.7 mm 디베이베이스트 나트륨 인산나트륨, pH 5.0)에서 항GFP 항체(2 μL/반응)를 자기 비드(25 μL/reaction)와 혼합합니다.
    2. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 50rpm으로 돌이십시오. 이어서, IgG-컨쥬게이드 비드를 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 함유 구연산산 인산완충액으로 3회 세척한다.
  3. 적절한 용해 버퍼를 사용하여 형질감염된 세포를 용해시합니다. 대표적인 데이터를 획득하기 위해, 용해 완충제 400 μL(50 mM Tris-HCl)에서 얼음상에서 30분 동안 형질감염된 세포를 용해; pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.5% 폴리 (옥스예헬렌) 옥틸페닐 에테르) 40 μmol/L 페닐메틸설포닐 불소, 50 μg/mL leupeptin, 50 μg/ mL 아프로티닌, 200 μmol/L 나트륨 오르토바나데이트, 및 1 mMM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)을 1.5 mL 시험관에서 24시간 후 트랜스펙션 후.
  4. 15,000 x g에서 원심분리하여 5 분 동안 용해기를 지우고 상급체를 수집합니다.
  5. 포세이트 사전 클리어. 라벨이 부착되지 않은 자기 비드(25 μL/반응)를 1.5mL 시험 튜브에 추가합니다. 구연산염 인산완충제 500 μL로 구슬을 세 번 씻으자. 구연산염 인산염 완충제를 최종 세척시 제거한 후, 세포가 자기 구슬 위에 매해 를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 50rpm에서 회전자를 사용하여 혼합물을 회전시다.
  6. 자기 분리를 위해 5 분 동안 자기 스탠드에 시험관을 놓고 세포 용해를 수집합니다. 제조업체에서 지정한 마그네틱 스탠드를 사용하는 것이 좋습니다.
  7. 표적 단백질을 컨쥬게이팅된 비드에 결합합니다. 면역 글로불린 (Ig)G-이형 비드를 자기 분리를 위해 5 분 동안 자기 스탠드에 놓고 구연산염 완충액을 버린 다음 분리 된 비드에 세포 용해액을 추가하십시오.
  8. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 50rpm으로 돌이십시오.
  9. 표적 단백질을 자유 비표적 단백질로부터 분리한다. 구연산염 인산염 완충액 500 μL을 사용하여 구슬을 3회 세척하여 0.1% 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 함유. 최종 세척 후, 구연산염 완충제(pH 2-3)의 30 μL을 추가하고, 대상 단백질을 용해시키기 위해 실온에서 5분 동안 배양한다.
    참고: 면역 침전으로부터의 회복이 충분하지 않은 경우, FLAG 또는 HIS와 같은 대체 에피토프 태그를 사용하면 효율이 향상될 수 있습니다. 용출의 효율이 불충분하면, SDS 기반 용액과 같은 다른 용출액의 사용은 효율을 향상시킬 수 있다.

2. 단백질의 온 막 소화

참고: 외인성 단백질로 오염되는 것을 방지하려면 단백질이 없는 재료와 장비를 사용하는 것이 필요합니다. 또한 작업자는 인체 단백질에 의한 오염을 피하기 위해 수술용 마스크와 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.

  1. PVDF 멤브레인을 메탄올로 닦아 서 사용하기 직전에 건조시킨 수술용 가위를 사용하여 PVDF 멤브레인을 3mm x 3mm 조각으로 자릅니다.
  2. 깨끗한 알루미늄 호일에 PVDF 멤브레인 조각에 에탄올 2-5 μL을 추가합니다.
  3. 완전히 건조되기 전에 용출액 (각각 2-5 μL, 샘플 당 4-6 개)을 친수성 PVDF 멤브레인에 추가한 다음 멤브레인 표면이 매트해질 때까지 멤브레인을 공기 건조시킵니다. 건조 막은 4°C에서 보관할 수 있다.
  4. 모든 멤브레인을 1.5 mL 플라스틱 튜브로 옮기고 20-30 μL의 에탄올을 첨가하여 막을 친수성으로 만들고 파이펫을 사용하여 에탄올을 제거하십시오.
  5. 멤브레인이 완전히 마르기 전에 디티오트레이톨(DTT) 기반 반응 용액(80 mM NH4HCO3,10 mM DTT 및 20% 아세토니트릴)을 넣고 56°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  6. 반응 용액을 300 μL의 요오도아세타미드 용액 (80 mM NH4HCO3,55 mM iodoacetamide 및 20 % 아세토니트릴)으로 교체하고 어둠 속에서 실온에서 45 분 동안 배양하십시오.
  7. 증류수 1 mL로 멤브레인을 두 번 씻고 >10s용 소용돌이 혼합으로 2% 아세토니트릴 1mL로 한 번 씻습니다.
  8. 반응 용액(30 mM NH4HCO3 70% 아세토니트릴을 함유)에 직접 용해된 MS급 트립신(재료표)을 용해한다. 트립신 1 μg(재료 표)(30 mM NH4HCO3 함유 70% 아세토니트릴 포함)를 함유한 반응 용액의 100 μL을 넣고 밤새 37°C에서 배양한다.
  9. 파이펫을 사용하여 트립틱 다이제스트를 함유한 반응 용액을 깨끗한 1.5 mL 시험관으로 옮김을 전달한다.
  10. 100 μL의 세척 액 (70 % 아세토니트릴 / 1 % 트리플루오 아세트산)을 멤브레인에 넣고 60 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오. 멤브레인에 100 μL의 세척 액을 추가하고 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 그런 다음 세척 용액을 수집하고 반응 용액과 혼합하십시오.
  11. 실험실 필름의 조각으로 시험관을 덮고 바늘로 작은 구멍의 몇 가지를 합니다. 진공 농축기로 용액을 건조시고 건조시면 됩니다.
  12. 잔류물을 0.2% 포르믹산의 10 μL로 용해시. 원심 분리 후 (12,000 × g, 실온에서 3 분), 상급을 샘플 튜브로 옮긴다.
    참고: 이 섹션의 중요한 단계는 세서입니다. 온막 단백질 소화 동안, 증류수로 환원 및 알킬화 후 고정화 단백질을 함유하는 멤브레인을 세척하고, 2% 아세토니트릴을 각각 10초 이상 제거하는 것이 시약의 제거에 매우 중요하다.

3. LC-전기 분무 이온화 (ESI)-MS/MS 분석

  1. 나노 LC HPLC 시스템(재료표)과 결합된 ESI-MS/MS 계측기(재료표)를활성화합니다. 사전 열(재질표)과 해석 열(재질표)을연결합니다.
  2. 분석에 앞서 표준 펩타이드를 제공하는 0.2% 포머산에 용해된 소 혈청 알부민의 트립틱 다이제스트를 사용하여 질량 분석기를 교정합니다.
  3. 포지티브 이온 모드와 질량 범위가 400-1,250 m/z를 사용하여 시료를 분석합니다. 그런 다음 질량 범위가 100-1,600 m/z이고 선형 구배가 2%-80% 아세토니트릴및 0.2% 포름산을 300 nL/min의 유량으로 80분 동안 최대 10MS/MS 스펙트럼(각 100ms)까지 획득합니다.
  4. 단백질 식별을 위한 소프트웨어를 사용하여출력 데이터를 분석(재료 표)을 사용하여 후보 관련 단백질을 식별합니다. 후보 단백질의 양성 동정을 위해, 적어도 하나의 고충실도 펩티드 단편(> 95% 충실도)의 검출이 요구된다.
  5. GFP 발현 용해물(GFP 태그를 단독으로 발현하는 벡터의 형질전환)에서 유사하게 침전되는 단백질을 후보 단백질 목록에서 생략한다.
    참고: 데이터베이스 분석에서 몇몇 단백질이 확인되는 경우에, MS/MS 취득 조건의 수정 (예를 들면, 각각 100 ms에서 50 ms각각으로 시간을 변경)는 확인된 단백질의 수를 증가시킬 수 있습니다.

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결과

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전술한 절차에 의해, 면역침전제는 LC-MS/MS를 사용하여분석하였다(도 1). 외인성 유래 단백질(다른 종 및 IgGs의 단백질)을 배제한 후, 17개의 단백질이 칼파인-6-관련면역침전제(표 1)에서 확인되었고, 15개의 단백질은 GFP 관련 면역침전제에서 확인되었다. 표2). 칼파인-6 및 GFP 관련 단백질 중, 11개는 면역침전제모두에서 확인되었다(도 2). 일단 이들 및 칼파인-6 자체가 제외되면, 5개의 후보 칼파인-6-관련 단백질이 남아 있었다: 보완 C1q 소성분 소단위 C, 각질 형 II 시토스켈레탈 8, IgE 결합 단백질, ADP/ATP 트랜스로케이스 1, 및 유비퀴틴.

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토론

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우리는 이전에 온 막 소화 기술에 선행된 LC-MS/MS를 사용하여 산화된 저밀도 지단백에 있는 아폴리포단백질 B-100의 산화수정의 분석을 기술했습니다 6. 본 연구에서, 우리는 면역 침전과 이 기술을 결합하고 몇몇 calpain-6 관련 단백질을 확인했습니다. 이러한 신규 한 기술은 후보 관련 단백질에 대한 편리한 스크리닝 방법을 나타낸다. Calpain-6는 단백질-단백질 상호작용12,13을통해 세포 기능을 변형시킨 칼파인 단백질용해패밀리(11)의 비단백질용해부재이다. 온막 소화 기술을 사용하여, 우리는 이전에 다른 MS 셋업12를채택하는 그밖 calpain-6 관련 단백질을 확인했습니다. 따라서 식별된 후보 수를 최대화하기 위해 여러 MS 조건을 테스트하는 것이 좋습니다. 같은 이유로, 사용...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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본 연구는 일본과학교부교부제 17K09869(오전), 일본과학교부교15K09418(TM)의 연구보조금인 가네하라 이치로의학재단의 연구보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 스즈켄 기념재단(TM)의 연구보조금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴와코014-00386
구연산와코030-05525
DiNAKYA 테크나노 플로우 고성능 액체 크로마토 그래
DiNa AIKYA Tech Co.오토샘플러를 탑재한 나노플로우 고성능 액체 크로마토그래피
DTT,Nacalai, tesque14112-94
Dynabeads protein G, Thermo Fisher, Scientific10003D
포름산, Wako066-00461
HiQ, Sil, C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000.10mmID * 100mmL
요오드아세트아미드Wako095-02151
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Living Colors A.V. 단클론 항체 (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH4HCO3Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507폴리(옥시에텔렌)옥틸페닐에테르(n=9)
펩타이드 규격KYA TechtBSA-04소 혈청 알부민 PP 바이알의 트립틱 다이제
KYA Tech Co.03100S플라스틱 샘플 튜브
프로테아제 억제제 cooctailSigmaP8465
ProteinPilot 소프트웨어단백질 식별을 위한Sciex5034057
시퀀싱 등급 수정 트립신PromegaV5111트립신
오르토바나데이트 나트륨시그마S6508
인산나트륨 이염기성 이수화물시그마71643
TFAWako206-10731
트랩 컬럼KYA Tech Co.A03-05-0010.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 시스템Sciex4466015하이브리드 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분석기
TrisWako207-06275
Tween-20Wako160-21211
피 , , , , , 스트 소프트웨어

참고문헌

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