고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

Summary

생화학 분석과 결합된 단백질 결합 마이크로어레이(PBM) 실험은 DNA 프리마제의 결합 및 촉매 특성을 연결하며, 이는 템플릿 DNA에 RNA 프라이머를 합성하는 효소입니다. 고처리량 프리마제 프로파일링(HTPP)으로 지정된 이 방법은 다양한 효소의 DNA 결합 패턴을 밝히는 데 사용될 수 있다.

Abstract

DNA 프리마제는 DNA 복제 중에 DNA 폴리머라제에 의해 지연 가닥에 오카자키 단편의 DNA 합성을 시작하는 짧은 RNA 프라이머를 합성합니다. DNA에 원핵 DNAG 같이 프리마제의 결합은 특정 삼중뉴클레오티드 인식 순서에서 생깁니다. 그것은 오카자키 조각의 형성에 중요한 단계입니다. DNA 프리마제의 DNA 인식 서열을 결정하는 데 사용되는 기존의 생화학 적 도구는 제한된 정보만을 제공한다. 고처리량 마이크로어레이 기반 결합 분석 및 연속적인 생화학 적 분석을 사용하여 1) 특정 결합 컨텍스트 (인식 부위의 측면 서열)가 DNA 프리마제의 결합 강도에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. DNA, 및 2) DNA에 프리마제의 강한 결합은 효소의 더 높은 처리율을 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 산출한다. 이 방법은 PBM 및 프리마제 활성 분석법을 결합하고 고처리량 프리마제 프로파일링 (HTPP)으로 지정되며 전례없는 시간과 확장성에서 DNA 프리마제에 의한 특정 서열 인식의 특성화를 허용합니다.

Introduction

HTPP는 생화학 적 분석과 결합 된 DNA 결합 마이크로 어레이 기술을 사용하여DNA프리마제의 효소 활성에 영향을 미치는 DNA 템플릿의 특정 특징을 통계적으로 식별합니다. 따라서 HTPP는 현장에서 지식의 도약을 촉진하는 기술 플랫폼을 제공합니다. 원시 인식 사이트를 결정하는 데 사용되는 고전적인 도구는 HTPP가 수행하는 반면, 엄청난 양의 데이터를 얻을 수있는 능력이 없습니다.

PBM은 DNA^1,2에대한 전사 인자의 결합 선호도를 결정하기 위해 일상적으로 사용되는 기술이다. 그러나, DNA에 단백질의 약 /과도 결합의 검출에 적합하지 않습니다. 8개의 염기 쌍으로 구성된 모든 가능한 서열에 평균 단백질 결합 특이성에 대한 정보를 제공하는 보편적인 PBM과는 달리, HTPP는 독특한 서열 요소를 포함하는 단일 가닥 DNA 템플릿의 라이브러리를 기반으로 한다. 이러한 DNA 서열 요소는 수만 짧은 (bp의 몇 수) 게놈 서열뿐만 아니라 다른 평균 GC 함량을 가지고 게놈에 존재하는 특정 DNA 반복적 인 서열 요소에 풍부 하게 계산 설계 DNA 서열을 포함 . 이러한 높은 처리량 접근법은 체계적이고 정량적이며 가설 구동적인 방식으로, 프리마제 결합 및 그 효소 활성에 중요한 서열 관련 특성을 결정할 수 있게^{한다 3.} 특히, 프리마제-DNA 결합 선호도(특정 삼중 뉴클레오티드 결합 부위를 측면으로 하는 DNA 서열에 의해 변조)와 프리마제 처리율 사이의 중요한 링크가 이러한 효소 시스템^4에대해 확인되었다.

이 새로운 기술은 광범위하게 연구된 T7 DNA 프리마제에 대해서도 프리마제 인식 부위에 대한 우리의 이해를 재검토하기 위해 적용되었다^5. 구체적으로, 단백질 DNA 결합 마이크로어레이(PBM)를 사용하여 T7 DNA 프리마제(거의 4년 전 ^6년전에 결정된)의 DNA 인식 부위와 같은 고전적인 개념의 재검사는 이러한 인식 사이트의 측면 시퀀스^3. T7 DNA 프리마제(5'-GTC-3')의 삼중뉴클레오티드 인식 부위를 측면으로 하는 서열이 무작위일 것으로 예상되었다. 대신, 우리는 TG가 풍부한 측면 서열이 처리율의 증가를 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 합성하는 T7 DNA 프리마제의 기회를 증가한다는 것을 것을을 발견했습니다.

시험관 내 단백질의 DNA 결합 특성을 연구하는 데 사용할 수 있는 다른 방법은 전기 영동 이동성 시프트 분석법(EMSA)^7,DNase I 풋프린트^8,표면 플라스몬 공명(SPR)^9,및 남서부 블로팅을 포함합니다. ¹⁰. 그러나, 이들은 적은 수의 DNA 서열을 조사하는 데에만 적용 가능한 저처리법입니다. 또한, 이러한 기술 들(예를 들어, EMSA)의 정밀도 및 감도는 낮다. 한편, 시험관내^{선택(11)은} PBM과 유사하게, 수많은 결합 서열의 식별을 위해 사용될 수 있는 기술이다. 그러나, 낮은 친화도 서열은 일반적으로 시험관 내 선택의 대부분의 응용 프로그램에서 제외; 따라서 이 방법은 사용 가능한 모든 시퀀스에 대한 비교 바인딩 데이터를 가져오는 데 적합하지 않습니다. 범용 PBM^1,2는 주로 원핵생물 및 진핵생물로부터의 전사 인자의 결합 특이성뿐만 아니라 특정 인자(예를 들어, 특정 리간드, 보조 인자 등)의 결합 특이성을 특성화하는 데 사용됩니다. 이 상호 작용에 영향을^{미치는 12}.

HTPP는 전례없는 높은 처리량의 통계적 파워와 높은 정밀도를 결합하여 결합 서열 컨텍스트에 대한 정보를 제공함으로써 PBM 응용 프로그램을 DNA 처리 효소로 확장합니다. 이러한 데이터는 다른 사용 가능한 기술의 전술한 기술적 한계로 인해 프리마제 및 관련 효소(DNA에 약/과도 결합)에 대해 아직 획득되지 않았습니다.

Protocol

1. 마이크로어레이 의 설계

참고: DNA 프로브는 2개의 가변 측면 영역 사이에 위치한 T7 DNA 프리마제(GTC)에 대한 인식 부위로 구성된 맞춤형 36-뉴클레오티드 서열을 나타내고, 이어서 유리 슬라이드^3에연속된 일정한 24-뉴클레오티드 서열이 뒤따른다. 우리는 4 x 180,000 마이크로어레이 형식을 사용하여 슬라이드에 무작위로 분포된 6개의 복제본에서 각 DNA 서열을 발견할 수 있었습니다.

1. 알려진 인식 서열을 가진 프리마제용 DNA 라이브러리 설계
   1. 각 서열이 60개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는지 확인합니다. 처음 24개의 뉴클레오티드를 일정하게 유지한다(유리 슬라이드에 부착). 가변 영역은 다음과 같은 일반적인 형태를 가져야 한다: (N)₁₆GTC(N)_17; 여기서 N은 원하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
   2. 특정 과학적 질문을 해결하기 위해 측면 영역을 디자인합니다(디자인의 예는 다음 텍스트에 표시되어 있음). 측면 영역은 반복 요소 또는 특정 대칭과 같은 특정 피쳐를 포함하도록 설계될 수 있습니다.
      참고 : 우리는 두 개 또는 세 개의 특정 뉴클레오티드로 구성된 다른 측면 서열의 8 가지 범주를 만들었습니다: T와 G (그룹 1); T 및 C(그룹 2); C 및 A(그룹 3); A 및 G(4군); G, C 및 T(그룹 5); C, T 및 A(그룹 6); G, A 및 T(그룹 7); G, A 및 C(8군). 2,000개의 서로 다른 시퀀스가 각 그룹에 대해 설계되었습니다. 각 그룹에는 서로 다른 유형과 서로 다른 수의 시퀀스 반복을 가진 하위 그룹이 있었습니다.
   3. 네거티브 컨트롤 서열 세트(특정 바인딩 사이트^{부족)를 포함합니다 4.} 이러한 서열의 존재는 실험에서 특정 결합의 발생을 검증할 수 있게 한다.
2. 알 수 없는 인식 시퀀스가 있는 프리마제용 DNA 라이브러리 설계
   1. 인식 서열이 알려지지 않은 경우, 원하는 유기체(박테리아, 곰팡이 등)의 게놈으로부터 서열을 선택하여 DNA 라이브러리를 생성합니다(앞서 언급한 특정 특징의 유무에 관계없이).
3. 마이크로어레이 슬라이드 설계
   1. 상업용 공급업체에서 사용자 지정 슬라이드(예: 4x180K, AMADID #78366)를 구매하십시오(자세한 내용은 재료 표참조). 각 복제가 슬라이드에서 임의로 선택된 지점에 연결되어야 하는 6개의 복제에서 각 시퀀스를 정렬합니다.

2. 프리마제 DNA 결합 실험

참고: PBM 전날(또는 적어도 2시간 전) 차단 용액 [인산완충식염수(PBS)에 2% 또는 탈지 유)]를 준비하고 마그네틱 교반기에서 저어줍니다. 사용하기 전에 0.45 μM 필터로 용액을 필터링하십시오. DNA 가닥에 대한 프리마제 결합을 검출하려면 다음 순서로 몇 단계를 수행해야 합니다.

1. 차단 절차
   1. PBS에서 0.01% v/v 트리톤 X-100(실험실 회전자에서 125rpm에서 5분)으로 코플린 병에 마이크로어레이 슬라이드를 미리 적시십시오.
   2. 간략하게 물과 에탄올로 개스킷 슬라이드 (커버 슬립라고도 함)를 세척하고 압축 공기를 사용하여 건조.
   3. 개스킷 슬라이드가 위로 향하여 강철 혼성화 챔버(PBM chamber)의 하단 부분을 조립합니다(상업용 라벨이 위로 향합니다). 어셈블리에 대한 자세한 내용은 재료 표를참조하십시오.
   4. 각 챔버에 파이펫 차단 용액 (PBS에서 2 % v 탈지 우유).
   5. 코플린 항아리에서 마이크로어레이 슬라이드를 제거한 다음 DNA가 아닌 면(DNA가 회사 라벨과 같은 쪽에 있어야 합니다)과 미세한 물티슈를 사용하여 가장자리를 건조시면 됩니다. 기포(회사 라벨이 아래를 향하게 하는 경우)를 피하면서 개스킷 슬라이드에 마이크로어레이를 천천히 놓습니다. 즉시 조립 및 강철 하이브리드 화 챔버 장치를 조여. 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
   6. 800 mL의 신선한 PBS로 염색 접시 ("PBS"요리)를 채웁니다. 두 번째 염색 접시 ("WASH"접시)를 PBS에서 갓 준비 한 0.5 % v / v Tween-20 800mL로 채웁니다.
   7. PBM 챔버를 풀고 씰을 부러뜨리지 않도록 주의하면서 마이크로어레이 슬라이드 커버슬립 "샌드위치"를 제거합니다. 슬라이드와 커버 슬립 사이에 집게를 배치하여 워시 접시에서 수중분해.
   8. 마이크로어레이 슬라이드를 수중으로 흔들어 코플린 항아리로 빠르게 옮김을 합니다.
   9. PBS에서 0.1% v/v 트위엔-20으로 한 번 씻으소서 (실험실 회전자에서 125rpm에서 5분).
   10. PBS에서 0.01% v/v 트리톤 X-100으로 한 번 씻으소서(실험실 회전자에서 125rpm에서 2분).
   11. 슬라이드를 PBS가 들어 있는 코플린 항아리로 빠르게 옮김.
2. 단백질 결합
   1. 앞서 설명한 대로 PBM 챔버를 조립합니다(단계 2.1.2-2.1.3).
   2. 5 μM T7 DNA 프리마아제, 30 mM Tris-HCl pH 7.5, 6.5 mM MgCl_2,30 mM K-글루타메이트, 6mM dithiothreitol (DTT), 65 μM 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (rNTP), 2% w/v 탈지 우유, 100 ng/μL 소 혈청 알부민 (BS0) 연어 고환 DNA, 및 0.02 % v / v 트리톤 X-100 (TX-100) 개스킷 슬라이드의 각 챔버에 (고무 측면을 건드리지 않고 거품을 도입하지 않고).
   3. 슬라이드 표면에서 과도한 세제를 제거하는 PBS 접시에 담그어 마이크로어레이 슬라이드를 간략하게 헹굽습니다. 슬라이드의 DNA가 아닌 표면을 미세한 물티슈로 닦습니다.
   4. 한 챔버에서 다른 챔버로의 누출을 방지하기 위해 주의하면서 마이크로어레이 슬라이드(아래를 향하도록)를 개스킷 슬라이드위로 천천히 낮춥니다. 기포를 도입하지 않고 즉시 PBM 챔버 장치를 조립하고 조입니다. 거품이 형성되면 강철 챔버를 단단한 표면에 부드럽게 두드려 제거 할 수 있습니다.
   5. 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
3. 형광 항체 부착
   1. PBM 챔버를 풀고 씰을 부러뜨리지 않도록 주의하면서 마이크로어레이 슬라이드 커버슬립 "샌드위치"를 제거합니다. 집게를 사용하여 워시 접시에서 수중을 분해하십시오. 슬라이드를 수중으로 흔들어 빠르게 PBS가 들어있는 코플린 항아리로 옮김을 옮김.
   2. 앞서 설명한 대로 개스킷 슬라이드로 PBM 챔버를 조립합니다(단계 2.1.2-2.1.3).
   3. 개스킷 슬라이드에 Alexa 488-컨쥬게이트 항-그의 항체(결합 완충액10 ng/μL)를 추가합니다.
   4. 이전과 같이 PBS 접시에 담그고 슬라이드를 짧게 헹구고 PBS에서 슬라이드를 천천히 제거하고 DNA가 아닌 표면을 닦아 서 개스킷 슬라이드에 향하게 놓습니다.
   5. 어두운 RT에서 30 분 배양 (형광 프로브는 빛에 민감함) 사진 표백을 줄이기 위해.
   6. 이전과 같이 PBM 챔버와 커버 슬립을 분해하여 워시 접시에서 수중 커버슬립을 제거합니다.
   7. 슬라이드를 PBS 접시에 담그고 간단히 헹굽습니다. 압축 공기로 슬라이드를 건조시면 됩니다. 스캔할 준비가 될 때까지 슬라이드 상자에 어두운 색으로 보관하십시오.
4. 마이크로어레이 슬라이드 스캐닝
   1. 495 nm의 여기와 519 nm의 방출로 마이크로 어레이 스캐너 (재료 표참조)를 사용하여 칩을 스캔하고 중간 형광 강도를 수집합니다.

3. 마이크로어레이 데이터 분석

참고: 모든 데이터 처리는 MATLAB에서 사용자 지정 스크립트를 사용하여 수행되었습니다.

1. 앞서 설명한 대로 Wilcoxon 순위 합계 테스트 p-값을 사용하여 초기 PBM 데이터 처리를^{수행합니다}4.
2. 추가 분석을 위해 각 DNA 서열에 대한 결합 강도의 중앙값을 사용합니다.
3. 다음으로, 단방향 ANOVA p-값을 사용하여, DNA 라이브러리 설계 섹션^3에서전술한 바와 같이, DNA 프로브의 상이한 그룹에 대해 수득된 프리마제-DNA 결합 강도에서 관찰된 차이의 통계적 유의성을 비교한다.

4. T7 DNA 프리마제에 의해 촉매 된 템플릿 지향 RNA 합성

1. 폴리아크릴아미드 젤 변성 준비
   1. 젤 혼합물 100 mL을 준비하려면, 62.5 mL의 40% 아크릴아미드-비사크릴라미드(19:1), 42 g의 우레아를 결합하고, 트리스 염기 1.1 g (2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올), 붕산 0.55 g, 0.4 mm 의 0.4 mL 의 에틸렌디아미네테트라 아세트산(EDTA) 용액.
   2. 혼합물을 14 mL aliquots (16.5 cm x 26 cm x 0.03 cm의 젤 1 개에 필요한 양)로 나누고 최대 1 개월 동안 4 °C에서 빛으로부터 보호하십시오.
   3. 하나의 변성 폴리아크릴아미드 겔을 제조하려면, 이전에 제조된 혼합물의 14 mL에 TEMED 4 μL과 40 μL의 10% w/v 황황산 암모늄을 넣고, 캐스팅하고 RT에서 적어도 2시간 동안 중합하도록 방치한다. 겔은 4°C에서 1일 동안 보관할 수 있다.
2. 샘플 준비
   참고: 시약, 반응 혼합물 및 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
   1. 10개의 반응에 필요한 반응 혼합물을 준비하기 위해 5x 활성 완충제의 11 μL(200 mM Tris-HCl, pH=7.5; 50 mM 디티오트레이톨, 250 mM 칼륨 글루타메이트, 50 mM MgCl_2),5.5 μL의 5.5 μL의 5.5 μL의 뉴클레오티드 삼인화물(NT-인산염) 방사성 표지리보뉴클레오티드 [예를 들어, ATP, (α-32P) 3000 Ci/mmol].
      참고: 파이펫팅 오류로 인해 모든 양이 10% 증가했습니다. 방사성 표지된 리보뉴클레오티드는 방사성 신호의 강도에 따라 희석되어야 합니다(초기 희석은 일반적으로 1:10 이상임).
   2. 반응 혼합물의 2 μL을 10개의 PCR 튜브로 이송한다.
   3. 해당 PCR 튜브에 1 μL의 1 μL을 추가하고 스핀다운합니다.
   4. 16 μM T7 DNA 프리마제 2 μL을 넣고, 스핀다운하고, 부드럽게 섞은 다음, 다시 스핀다운합니다.
   5. RT에서 20 분 동안 반응을 배양하십시오.
   6. 담금질 용액 5 μL(포름아미드 95%, 20 mM EDTA, 0.05% w/v 자일렌 시안및 브로모페놀 블루)을 첨가하여 반응을 멈추고, 혼합하고, 스핀다운한다.
3. 변성 폴리아크릴아미드 겔 및 후속 신호 검출을 통해 전기 동열에 의한 RNA 제품 분리
   1. 1x TBE 버퍼(90 mM 트리스 붕산, 2 mM EDTA)에서 1시간(10 mA, 600 V)에 대한 젤을 미리 실행한다.
   2. 각 시료의 최대 2 μL을 로드하고 1x TBE 버퍼(90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA)에서 전기 영동(20 mA, 1100V)을 수행합니다.
   3. 80°C에서 2시간 동안 젤을 진공 에서 건조시다.
   4. 방사성 신호의 강도에 따라 몇 시간 에서 하룻밤 동안 방사성 겔에 인광체 이미징 플레이트를 노출시다.
   5. 인광체화체를 사용하여 신호(광자극 발광)를 기록합니다(재료 표참조).

Results

프리마제 결합 부위를 매핑하기 위한 이러한 기술적 진보는 고전적 도구를 사용하여 관찰하기 어려운 DNA 결합 특성을 얻을 수 있게 한다. 더 중요한 것은, HTPP는 프리마제 바인딩 사이트의 전통적인 이해를 다시 방문 할 수 있습니다. 구체적으로, HTPP는 알려진 5'-GTC-3' 인식 서열 이외에 결합 특이성을 밝혀, 이는 T7 DNA 프리마제의 기능적 활동의 변화로 이어진다. 즉, 서열의 두 그룹이 확인되었다: 측면에 T/G를 포함하는 강한 결합 DNA 서열과 측면에 A/G를 포함하는 약한 결합 서열 (강한 결합 템플릿에 있는 모든 티민은 아데닌으로 대체되었다). 그들의 서열 내에서 5'-GTC-3'가 누락된 DNA 템플릿에 대한 프리마제 결합이 검출되지 않았다.

T/G가 풍부한 측면과 같은 특정 특징을 포함하는 프리마제 DNA 인식 부위는 최대 10배까지 ...

Discussion

PBM 방법은 전사 인자의 결합 특성을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔으며 DNA 프리마제와 같은 DNA 처리 효소에 적용되어 친화성이 낮은 DNA에 결합할 수도 있습니다. 그러나 실험 절차의 특정 수정이 필요합니다. 마이크로어레이 실험은 DNA 라이브러리의 설계, 칩의 준비, 단백질 표적의 결합, 형광 표지 및 스캐닝과 같은 여러 단계를 수반합니다. 세제를 함유한 용액을 가진 긴 세척은 결합의 약한/과도 모드로 인해 DNA 템플릿에서 단백질의 해리를 유발하기 때문에 온화한 세척 단계는 중요합니다. 그밖 중요한 단계는 각각 특정 효소를 위해 최적화될 필요가 있는 결합 조건 (예를 들면, 완충 조성물, 보조 인자) 및 인큐베이션 시간을 포함합니다.

마이크로어레이로부터 얻은 결과는 생화학적 분석을 통해 검증되어야 합니다. 생화학 적 화학 적 검사는 또한 DNA 결합 친화도 및 효소 활성 / 처리성 사이의 상관 관계와 같은 DNA 처리 효소의 흥미로운 기능에 대한 통찰력을 제공합니다....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% 아크릴아미드-비스아크릴아미드(19:1) 용액	머크	1006401000
95% 포름아미드	시그마-알드리치	F9037-100ML
알렉사 488-접합 항-his 항체	Qiagen	35310
과황산암모늄(APS)	시그마-알드리치	A3678-100G
ATP, [&알파;-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer
붕산, 과립	Glentham Life Sciences	GE4425
소 혈청 알부민(BSA)	로슈	10735094001
브로모페놀 블루	시그마-알드리치	B0126-25G
코플린 항아리
디티오트레이톨(DTT)	시그마-알드리치	D0632-25G
DNA 마이크로어레이	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	아크로스 유기물	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 인광분석기	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	여러 슬라이드를 사용하는 경우
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
염화마그네슘	Sigma-Aldrich	63064-500G
마이크로어레이 혼성화 챔버	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
마이크로어레이 스캐너(GenePix 4400A)	분자 소자
인산염 완충 식염수(PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
글루타민산칼	Alfa Aesar	A172232
리보뉴클레오티드 용액 혼합물(rNTP)	New England BioLabs	N0466S
연어 고환 DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
탈지 분유	Sigma-Aldrich	70166-500G
염색 접시	Thermo Scientific
테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)	바이오-라드	1610800
트리스 베이스(2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올)	시그마-알드리치	93362-500G
트리톤 X-100	시그마-알드리치	X100-500ML
트윈-20	시그마-알드리치	P9416-50ML
우레아	시그마-알드리치	U6504-1KG
크실렌 시안올	알파 Aesar	B21530