생화학 분석과 결합된 단백질 결합 마이크로어레이(PBM) 실험은 DNA 프리마제의 결합 및 촉매 특성을 연결하며, 이는 템플릿 DNA에 RNA 프라이머를 합성하는 효소입니다. 고처리량 프리마제 프로파일링(HTPP)으로 지정된 이 방법은 다양한 효소의 DNA 결합 패턴을 밝히는 데 사용될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
DNA 프리마제는 DNA 복제 중에 DNA 폴리머라제에 의해 지연 가닥에 오카자키 단편의 DNA 합성을 시작하는 짧은 RNA 프라이머를 합성합니다. DNA에 원핵 DNAG 같이 프리마제의 결합은 특정 삼중뉴클레오티드 인식 순서에서 생깁니다. 그것은 오카자키 조각의 형성에 중요한 단계입니다. DNA 프리마제의 DNA 인식 서열을 결정하는 데 사용되는 기존의 생화학 적 도구는 제한된 정보만을 제공한다. 고처리량 마이크로어레이 기반 결합 분석 및 연속적인 생화학 적 분석을 사용하여 1) 특정 결합 컨텍스트 (인식 부위의 측면 서열)가 DNA 프리마제의 결합 강도에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. DNA, 및 2) DNA에 프리마제의 강한 결합은 효소의 더 높은 처리율을 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 산출한다. 이 방법은 PBM 및 프리마제 활성 분석법을 결합하고 고처리량 프리마제 프로파일링 (HTPP)으로 지정되며 전례없는 시간과 확장성에서 DNA 프리마제에 의한 특정 서열 인식의 특성화를 허용합니다.
서론
HTPP는 생화학 적 분석과 결합 된 DNA 결합 마이크로 어레이 기술을 사용하여DNA프리마제의 효소 활성에 영향을 미치는 DNA 템플릿의 특정 특징을 통계적으로 식별합니다. 따라서 HTPP는 현장에서 지식의 도약을 촉진하는 기술 플랫폼을 제공합니다. 원시 인식 사이트를 결정하는 데 사용되는 고전적인 도구는 HTPP가 수행하는 반면, 엄청난 양의 데이터를 얻을 수있는 능력이 없습니다.
PBM은 DNA1,2에대한 전사 인자의 결합 선호도를 결정하기 위해 일상적으로 사용되는 기술이다. 그러나, DNA에 단백질의 약 /과도 결합의 검출에 적합하지 않습니다. 8개의 염기 쌍으로 구성된 모든 가능한 서열에 평균 단백질 결합 특이성에 대한 정보를 제공하는 보편적인 PBM과는 달리, HTPP는 독특한 서열 요소를 포함하는 단일 가닥 DNA 템플릿의 라이브러리를 기반으로 한다. 이러한 DNA 서열 요소는 수만 짧은 (bp의 몇 수) 게놈 서열뿐만 아니라 다른 평균 GC 함량을 가지고 게놈에 존재하는 특정 DNA 반복적 인 서열 요소에 풍부 하게 계산 설계 DNA 서열을 포함 . 이러한 높은 처리량 접....
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프로토콜
1. 마이크로어레이 의 설계
참고: DNA 프로브는 2개의 가변 측면 영역 사이에 위치한 T7 DNA 프리마제(GTC)에 대한 인식 부위로 구성된 맞춤형 36-뉴클레오티드 서열을 나타내고, 이어서 유리 슬라이드3에연속된 일정한 24-뉴클레오티드 서열이 뒤따른다. 우리는 4 x 180,000 마이크로어레이 형식을 사용하여 슬라이드에 무작위로 분포된 6개의 복제본에서 각 DNA 서열을 발견할 수 있었습니다.
-
알려진 인식 서열을 가진 프리마제용 DNA 라이브러리 설계
- 각 서열이 60개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는지 확인합니다. 처음 24개의 뉴클레오티드를 일정하게 유지한다(유리 슬라이드에 부착). 가변 영역은 다음과 같은 일반적인 형태를 가져야 한다: (N)16GTC(N)17; 여기서 N은 원하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
- 특정 과학적 질문을 해결하기 위해 측면 영역을 디자인합니다(디자인의 예는 다음 텍스트에 표시되어 있음). 측면 영역은 반복 요소 또는 특정 대칭과 같은 특정 피쳐를 포함하도록 설계될 수 있습니다.
참고 : 우리는 두 개 또는 세 개의 특정 뉴클레오티드로 구....
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결과
프리마제 결합 부위를 매핑하기 위한 이러한 기술적 진보는 고전적 도구를 사용하여 관찰하기 어려운 DNA 결합 특성을 얻을 수 있게 한다. 더 중요한 것은, HTPP는 프리마제 바인딩 사이트의 전통적인 이해를 다시 방문 할 수 있습니다. 구체적으로, HTPP는 알려진 5'-GTC-3' 인식 서열 이외에 결합 특이성을 밝혀, 이는 T7 DNA 프리마제의 기능적 활동의 변화로 이어진다. 즉, 서열의 두 그룹이 확인되었다: 측면에 T/G를 포함하는 강한 결합 DNA 서열과 측면에 A/G를 포함하는 약한 결합 서열 (강한 결합 템플릿에 있는 모든 티민은 아데닌으로 대체되었다). 그들의 서열 내에서 5'-GTC-3'가 누락된 DNA 템플릿에 대한 프리마제 결합이 검출되지 않았다.
T/G가 풍부한 측면과 같은 특정 특징을 포함하는 프리마제 DNA 인식 부위는 최대 10배까지 .......
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토론
PBM 방법은 전사 인자의 결합 특성을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔으며 DNA 프리마제와 같은 DNA 처리 효소에 적용되어 친화성이 낮은 DNA에 결합할 수도 있습니다. 그러나 실험 절차의 특정 수정이 필요합니다. 마이크로어레이 실험은 DNA 라이브러리의 설계, 칩의 준비, 단백질 표적의 결합, 형광 표지 및 스캐닝과 같은 여러 단계를 수반합니다. 세제를 함유한 용액을 가진 긴 세척은 결합의 약한/과도 모드로 인해 DNA 템플릿에서 단백질의 해리를 유발하기 때문에 온화한 세척 단계는 중요합니다. 그밖 중요한 단계는 각각 특정 효소를 위해 최적화될 필요가 있는 결합 조건 (예를 들면, 완충 조성물, 보조 인자) 및 인큐베이션 시간을 포함합니다.
마이크로어레이로부터 얻은 결과는 생화학적 분석을 통해 검증되어야 합니다. 생화학 적 화학 적 검사는 또한 DNA 결합 친화도 및 효소 활성 / 처리성 사이의 상관 관계와 같은 DNA 처리 효소의 흥미로운 기능에 대한 통찰력을 제공합니다........
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 이스라엘 과학 재단에 의해 지원되었다 (부여 번호 1023/18).
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재료
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| 95% 포름아미드 | 시그마-알드리치 | F9037-100ML | |
| 알렉사 488-접합 항-his 항체 | Qiagen | 35310 | |
| 과황산암모늄(APS) | 시그마-알드리치 | A3678-100G | |
| ATP, [&알파;-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | ||
| 붕산, 과립 | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 로슈 | 10735094001 | |
| 브로모페놀 블루 | 시그마-알드리치 | B0126-25G | |
| 코플린 항아리 | |||
| 디티오트레이톨(DTT) | 시그마-알드리치 | D0632-25G | |
| DNA 마이크로어레이 | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 아크로스 유기물 | AC118430010 | |
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| 마이크로어레이 혼성화 챔버 | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
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| 크실렌 시안올 | 알파 Aesar | B21530 |
참고문헌
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L.
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