여기서 설명된 것은 근육 저온절에서 괴사 성 근섬유의 직접 면역 라벨링을 위한 프로토콜이다. 괴사 세포는 면역 글로불린 G (IgG)를 포함하는 혈청 단백질에 투과성이다. myofibers에 의해 IgG의 섭취를 공개하면 근육 상태에 관계없이 괴사를 겪는 myofibers의 식별 및 정량화를 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
근육 섬유의 괴사 (myonecrosis)는 근육 이영양증을 포함한 여러 근육 조건의 발병 기전에서 중심적인 역할을합니다. 근 위축병발생의 원인을 해결하는 치료 옵션은 근육 변성을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 생검에서 세포 사멸 정도를 분석하고 정량화하는 방법이 필요하다. 종래의 방법은 장소에서 근섬유 변성을 관찰하는 것이 양적 또는 필수 염료의 주입에 의존한다. 본 문서에서, 면역형광 프로토콜은 myofibers에 의한 면역글로불린 G(IgG) 섭취량을 표적으로 하여 괴사 된 myofibers를 염색하는 것을 기술한다. IgG 섭취 방법은 1) 손상 관련 분자 패턴의 방출과 함께 혈장 막 무결성의 손실 및 2) 혈장 단백질의 섭취를 포함하여 괴사 멸망을 특징짓는 세포 특징을 기반으로 한다. 뮤린 단면에서, myofibers, 세포외 매트릭스 단백질 및 마우스 IgG의 공동 면역 표지는 괴사 운명과 myofibers의 깨끗하고 간단한 식별을 허용합니다. 이 간단한 방법은 정량 분석에 적합하고 인간 샘플을 포함한 모든 종에 적용 가능하며, 필수 염료의 주입을 필요로하지 않는다. IgG 섭취량에 의한 괴사 성 myofibers의 염색은 또한 다른 공동 면역 라벨링과 결합 될 수 있습니다.
서론
줄무늬 골격근은 주로 특징적인 자발적 수축 기능을 담당하는 근육 섬유 (myofibers)로 구성됩니다. 이 세포는 수축 도중 일어나는 기계적인 응고를 지원하는 다중 핵화, 포스트 유사분열 구조물입니다. 근섬유소막(사르콜엠마)과 세포외 매트릭스의 구조적 안정성은 조직 항상성에 매우 중요합니다. 위성 세포는 성숙한 골격 근에서 주요 근육 전구 집단을 구성하고 건강한 근육에서 정지 상태에 존재한다. myofiber 죽음 다음, 근육 재생은 궁극적으로 새로운 다핵근 화파이버를 형성하기 위해 위성 세포 활성화, 증식, 분화 및 융합을 포함하는 myogenic 프로그램을 따르는 위성 세포에 의해 지원됩니다.
Myofiber demise는 기계적 외상, 허혈 재관류 상해, 또는 근육 이영양증을 포함하는 다중 근육 조건에서 생길 수 있고, 죽은 세포의 괴사 형태와 연관된다1,2. 괴사염은 혈장막의 급속한 투과성 및 세포외 구획내의 세포 함량의 방출을 특징으로한다 3. 그것은 적절한 세포 신호 (즉, 우발적 인 괴사) 또는 오케스트레이션 된 세포 내 통로 (즉, 조절 된 괴사)를 포함하는 관계가없는 과정중 하나....
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프로토콜
실험은 프랑스 및 유럽 공동체 법규(라이센스 번호 11-00010)에 따라 수행되었습니다.
1. 트라가칸스 잇몸 준비
- 유리 비커에 100 mL의 탈이온수에 트라가칸스 분말 6 g을 녹입니다. 호일로 덮고 적어도 3 시간 동안 방치하십시오. 혼합물이 점성이 빠르게 됨에 따라 금속 주걱으로 수동으로 저어줍니다.
- 트라가칸스 혼합물을 수조 나 오븐에서 하룻밤 동안 60 °C에서 둡니다. 건조를 피하기 위해 비커를 조심스럽게 밀봉하십시오. 알리쿼팅하기 전에 적어도 한 번 저어주세요.
- 알리쿼트 및 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오.
2. 근육 수집
참고: 이 실험을 위해, 4주 된 남성 mdx 마우스는 자궁 경부 탈구에 의해 희생되었습니다. 이 절차는 마취를 필요로하지 않으며 현지 법률에 따라 인도적 살인 방법입니다.
- 경골 전방의 해부 (TA) 근육
- 마우스 다리를 면도 한 후 마우스를 등에 놓고 바늘로 코르크 보드에 발을 고정하십시오. 정밀 가위 (또는 메스)와 집게를 사용하여 발에서 무릎까지 다리 피부를 제거하여 경골과 TA의 전체 길이를 노출시하십시오....
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결과
묘섬유는 라미닌 함유 세포외 기질로 둘러싸여 있습니다. 붉은 얼룩은 근섬유 주변을 제한하고 식별을 허용합니다. IgG는 녹색으로 표시됩니다. 핵은 DAPI로 염색되고 현미경의 밑에 파란 찾아낸다. 그러나 핵은 여기에 흰색으로표시됩니다(그림 1). 약한 IgG 면역 반응성은 염증의 경우에 증가될 수 있는 세포외 구획에서 예상됩니다. 근섬유 내의 녹색 염색은 IgG의 존재를 반영합니다.
Mdx 마우스 TA는 3 주에 급성 근각증의 일시적인 단계를 특징으로하며, 그 다음에 비동기 변성 재생 이벤트가 뒤따릅니다. 그 결과, 4주된 mdx 마우스의 타스는 종종 동일한 단면에서 함께 저하 및 재생 영역을 포함하여 이질적인 프로파일을 표시한다(도1a).
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토론
Myofiber 괴사는 정상적인 근육에서 외상성 운동의 일반적인 결과입니다. 그것은 잘 로컬 근육 선조의 강력한 재생 능력에 의해 보상. 그러나, 여러 근육 조건에서 MDs에서, 위성 세포의 재생 용량 만성 근조와 과도 한 섬유 증에 의해 손상. 최근 연구 결과에 따르면 근육 섬유는 괴사의 규제 형태인 necroptosis에 의해 죽을 수 있습니다. 보다 구체적으로, necroptosis의 억제는 DMD 처리를 위한 새로운 치료 전략이 될 수 있습니다4. 근육 변성 장애에서 세포 사멸 경로를 조사하는 것은 근육 세포 사멸 정량화의 신뢰할 수있는 방법을 필요로한다. 이 프로토콜은 괴사를 겪은 myofibers를 표지하는 IgG 장악성 면역 형광 기술을 기술합니다.
괴사를 특징짓는 혈장 막 무결성의 손실은 손상 관련 분자 패턴의 방출과 알부민, IgG 및 IgM15와같은 혈장 단백질의 섭취로 이어집.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 Translamuscle 프로그램과 협회 프랑수아즈 콘트레 레 Myopathies에 의해 지원되었다. 저자들은 펄라 레예스-페르난데스 박사와 매튜 보록 박사가 원고를 주의 깊게 읽은 것에 대해 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 원형 코르크 디스크 | Pyramid Innovation | R30001-E | 냉동 후 샘플의 ID를 결정할 수 있도록 코르크에 명확하게 라벨을 붙이는 것을 잊지 마십시오 |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | 근육 동결 절제는 -20에서 -25°C 사이에서 수행해야 합니다. 두께: 7-10 마이크로미터. |
| Dakopen | Dako | S2002 | 근육 부분 주위의 소수성 장벽. 배양 중 배지의 변형을 방지합니다 |
| 겸자 | FST | 91117-10 | / |
| 염소 항 마우스 IgG (H+L) 항체, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | 희석: 1/500 |
| 염소 항 토끼 IgG (H+L) 항체 Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | 희석: 1/500 |
| 염소 혈청 | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | 차단 단계에서 PBS에 10% 희석액을 사용합니다. 항체 배양의 경우 PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | . 액체 질소에 넣은 비커에서 냉각해야 합니다. |
| mdx 마우스 | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx 마우스는 dystrophin 유전자에 대해 돌연변이가 있습니다. 생후 3주령부터 근육은 만성 퇴행이 특징입니다 |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | cryosection 고정에 사용(2% 또는 4% PFA 사용 가능) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | 희석 배지 면역 라벨링 |
| 정밀 가위 | FST | fst 14001-12 및 fst 14001-14 | 근육 수집에 사용 |
| 토끼 항체 마우스 pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | 희석 : 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4° 씨 |
참고문헌
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I.
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재인쇄 및 허가
