박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 원고는 두 박테리아 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 감지하고 특성화하기 위한 배양 기반의 동전 분석기를 설명합니다. 이 방법은 각 인구의 선택과 시각적 인 차별을 위해 각 인구가 뚜렷한 항생제 내성 기능 및 형광 단백질로 차별적으로 태그 될 수 있도록 안정적인 플라스미드를 사용합니다. 여기에서는, 우리는 경쟁하는 Vibrio fischeri 긴장, 형광 현미경 화상 진찰 및 정량적인 데이터 분석의 준비 그리고 동전을 기술합니다. 이 접근법은 간단하고, 빠른 결과를 산출하고, 한 집단이 다른 집단의 성장을 죽이거나 억제하는지, 그리고 경쟁이 확산 가능한 분자를 통해 매개되는지 또는 직접적인 세포 세포 접촉을 필요로 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 각 세균성 인구는 다른 형광 성 단백질을 표현하기 때문에, 분석은 혼합 된 식민지 내에서 경쟁 인구의 공간 차별을 허용합니다. 기재된 방법은 이 종에 최적화된 조건을 사용하여 공생 균 V. fischeri로 수행되지만, 프로토콜은 대부분의 균류균 분리에 적응될 수 있다.
서론
이 원고는 두 개의 세균 성 분리가 경쟁적인 상호 작용을 할 수 있는지 여부를 결정하는 문화 기반 방법을 간략하게 설명합니다. 혼합 인구를 연구할 때, 박테리아 격리가 상호 작용하는 정도, 특히 격리가 간섭 메커니즘을 통해 직접 경쟁하고 있는지 여부를 평가하는 것이 중요합니다. 간섭 경쟁은 한 집단이 직접 성장을 억제하거나 경쟁집단을 죽이는 상호 작용을 말합니다 1. 이러한 상호 작용은 미생물 커뮤니티의 구조 및 기능2,3에심오한 영향을 미칠 수 있기 때문에 식별하는 것이 중요합니다.
미생물 경쟁을 위한 기계장치는 호스트 관련및 자유로운 생활 박테리아를포함하여 다양한 환경에서 박테리아의 게놈에서 광범위하게 발견되었습니다 4,5,6,7, 8,9. ....
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프로토콜
1. 동전 큐브에 대한 균주를 준비
- 동전 분석 동안 세균 경쟁의 표적으로 작용할 적절한 기준 균주를 선택한다. 참조 변형률을 선택할 때의 모범 사례와 참조 변형이 결과에 미치는 영향에 대한 토론을 참조하십시오. 이 프로토콜에서, V. fischeri 스트레인 ES114는 기준 균주로서 작용할 것이다.
-
코인큐베이션에서 분리된 분리를 구별하기 위해 어떤 선택 및 스크리닝 방법을 사용할지 결정
- 전형적으로, 각 균주를 위해 선택하기 위하여 다른 항생 저항 유전자 (예를 들면 카나마이신 또는 클로람페니콜)를 포함하는 안정한 플라스미드를 가진 긴장을, 뿐만 아니라 다른 형광성 단백질 (예를 들면 GFP 또는 RFP)를 시각적으로 위해 칭하는 유전자를 선택합니다 공동 배양에서 균주 유형을 구별합니다.
참고: 변형이 선택의 부재에서 플라스미드를 잃는 경우, 다음이 균주의 숫자는 정량화 할 때 과소 평가될 것이기 때문에 안정적인 플라스미드의 사용이 필요하며, 형광 현미경 을 사용하여 시각적으로 검출되지 않습니다. - 태그 코인큐베이트 V. fischeri 균주는 하나의 균주가 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 항....
- 전형적으로, 각 균주를 위해 선택하기 위하여 다른 항생 저항 유전자 (예를 들면 카나마이신 또는 클로람페니콜)를 포함하는 안정한 플라스미드를 가진 긴장을, 뿐만 아니라 다른 형광성 단백질 (예를 들면 GFP 또는 RFP)를 시각적으로 위해 칭하는 유전자를 선택합니다 공동 배양에서 균주 유형을 구별합니다.
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결과
세균 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 평가하기 위해, 동전 분석 프로토콜이 개발되고 V. fischeri에최적화되었다. 이 방법은 항생 저항 유전자 및 형광 성 단백질을 인코딩하는 안정한 플라스미드를 활용하여 각 균주의 차등 선택 및 시각적 차별을 허용합니다. 동전 분석에서 수집된 데이터를 분석함으로써, 상호작용의 경쟁적 결과 및 상호작용의 메커니즘을 식별할 수 있다. 일례로, 다음의 실험은 V. fischeri 분리체를 사용하여 수행하였다. 동전 균주는 두 개의 안정적인 플라스미드 중 하나를 품고 있었다: pVSV102 카나마이신 저항 및 GFP +를 표현, 또는 pVSV208 클로람페니콜 저항 및 DsRed +를 표현. 샘플 데이터에서, 균주는 1:1 비율로 혼합하고 LBS 한천 플레이트에서 5시간 동안 배양하였다. 대조군 처리로서, 기준 균주의 차별화태그된 버전을 서로 코인큐베이팅하였다. 실험적 처리는 기준 균주(항만 pVSV102).......
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토론
전술한 코인큐브레이션 분석법은 박테리아 간 경쟁을 발견할 수 있는 강력한 방법을 제공한다. 이러한 접근법은 V. fischeri 격리 및 경쟁 메커니즘의 특성화 사이의 특정 경쟁의 식별을허용19. 기재된 방법은 해양 균 V. fischeri에최적화되었지만 임상 및 환경 분리를 포함한 다른 세균 종을 수용하기 위해 용이하게 변형될 수 있다. 경쟁 메커니즘은 종종 조건부 5, 6,23,24,25,26,27 규제된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다........
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 그들의 유용한 피드백에 대한 검토자에게 감사드립니다. A.N.S.는 그랜트 GBMF 255.03을 통해 고든과 베티 무어 재단의 지원을 받아 생명과학 연구 재단에 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μ L 멀티채널 피펫 | |||
| 100 μ L 멀티채널 피펫 | |||
| 300 μ L 멀티채널 피펫 | |||
| 10 μ L 싱글 채널 피펫 | |||
| 20 μ L 싱글채널 피펫 | |||
| 200 & L 싱글채널 피펫 | |||
| 1,000 μ L 단일 채널 피펫 | |||
| 24웰 플레이트 | Fisher | 07-200-84 | 멸균(뚜껑 포함 |
| 96웰 플레이트 | VWR | 10062-900 | 멸균(뚜껑 포함 |
| 계산기 | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 스톡(에탄올 중 20mg/mL);매체의 최종 농도(2 μ g/mL LBS)카메라 |
| 및 이미징 소프트웨어를 | |||
| 집게 | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize);매체 내 최종 농도 (1 μ g/mL LBS) |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인(FS MCE, 25MM, NS) | 피셔 | SA1J788H5 | 0.22 μ m 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (pk of 100) |
| 페트리 플레이트 | Fisher | FB0875713 | 뚜껑이있는 멸균 |
| 분광 광도계 | |||
| 세미 마이크로 큐벳 | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μ L 스타터 시스템 | USA Scientific | 1111-3500 | 10 랙 |
| TipOne 200 μ L 스타터 시스템 | USA Scientific | 1111-500 | 10 랙 |
| TipOne 1000 μ L 스타터 시스템 | USA Scientific | 1111-2520 | 10 랙 |
| Vortex | |||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| LBS media | |||
| 1 M 트리스 버퍼 (pH ~7.5) | 50 mL 1 M 스톡 버퍼(62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (플레이트에만 추가) |
| DI water | 950 mL | ||
| 염화나트륨 | Fisher | S640-3 | 20 g |
| 트립톤 | Fisher | BP97265 | 10 g |
| 효모 추출물 | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
참고문헌
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbi....
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