비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

Summary

박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

이 원고는 두 박테리아 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 감지하고 특성화하기 위한 배양 기반의 동전 분석기를 설명합니다. 이 방법은 각 인구의 선택과 시각적 인 차별을 위해 각 인구가 뚜렷한 항생제 내성 기능 및 형광 단백질로 차별적으로 태그 될 수 있도록 안정적인 플라스미드를 사용합니다. 여기에서는, 우리는 경쟁하는 Vibrio fischeri 긴장, 형광 현미경 화상 진찰 및 정량적인 데이터 분석의 준비 그리고 동전을 기술합니다. 이 접근법은 간단하고, 빠른 결과를 산출하고, 한 집단이 다른 집단의 성장을 죽이거나 억제하는지, 그리고 경쟁이 확산 가능한 분자를 통해 매개되는지 또는 직접적인 세포 세포 접촉을 필요로 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 각 세균성 인구는 다른 형광 성 단백질을 표현하기 때문에, 분석은 혼합 된 식민지 내에서 경쟁 인구의 공간 차별을 허용합니다. 기재된 방법은 이 종에 최적화된 조건을 사용하여 공생 균 V. fischeri로 수행되지만, 프로토콜은 대부분의 균류균 분리에 적응될 수 있다.

Introduction

이 원고는 두 개의 세균 성 분리가 경쟁적인 상호 작용을 할 수 있는지 여부를 결정하는 문화 기반 방법을 간략하게 설명합니다. 혼합 인구를 연구할 때, 박테리아 격리가 상호 작용하는 정도, 특히 격리가 간섭 메커니즘을 통해 직접 경쟁하고 있는지 여부를 평가하는 것이 중요합니다. 간섭 경쟁은 한 집단이 직접 성장을 억제하거나 경쟁집단을 죽이는 상호 작용을 말합니다 1. 이러한 상호 작용은 미생물 커뮤니티의 구조 및 기능^2,3에심오한 영향을 미칠 수 있기 때문에 식별하는 것이 중요합니다.

미생물 경쟁을 위한 기계장치는 호스트 관련및 자유로운 생활 박테리아^를포함하여 다양한 환경에서 박테리아의 게놈에서 광범위하게 발견되었습니다 4,^{5,6,7, 8,9}. 다양한 경쟁 전략이 기재된^10,11은 살균 화학물질 1,¹² 및분비된 항균 펩티드(13)와 같은 확산성 기전을 포함한다. 뿐만 아니라 표적 세포로 억제 효과를 전달하기 위해 세포 접촉을 필요로 하는 접촉의존적 메커니즘 9,^{14,15,16,17 ,18}.

배양 기반 동전은 일반적으로 미생물학5,^8,19에서사용되지만, 이 원고는 분석법을 사용하여 경쟁 메커니즘을 특성화하는 방법과 적응을 위한 제안을 간략하게 설명합니다. 다른 세균 종과 함께 사용하기위한 프로토콜. 또한 이 방법은 경쟁 상호 작용의 특성에 대한 다양한 질문에 답하기 위해 데이터를 분석하고 제시하기 위한 여러 접근 방식을 설명합니다. 여기에 기술된 기술은 이전에 비브리오 피셔리 박테리아(19)의 공생 균주 사이의 비특이적 경쟁기의 근본적인 교단 내 생존 메커니즘을 확인하기 위해 사용되었지만, 이들은 환경 분리및 인간 병원균을 포함한 많은 세균종은 접촉 의존성 및 확산성 경쟁 메커니즘을 평가하는 데 활용될 수 있다. 프로토콜의 단계는 다른 세균 종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 더 많은 모델 시스템이 다른 유전자형을 포함하는 등소원 성 유기체의 사용을 넘어 연구를 확장하고 있음을 감안할 때^10,16,20,21,이 방법은 귀중한 자원이 될 것입니다. 경쟁이 다중 균주 또는 다종 시스템에 미치는 영향을 이해하고자하는 연구자.

Protocol

1. 동전 큐브에 대한 균주를 준비

1. 동전 분석 동안 세균 경쟁의 표적으로 작용할 적절한 기준 균주를 선택한다. 참조 변형률을 선택할 때의 모범 사례와 참조 변형이 결과에 미치는 영향에 대한 토론을 참조하십시오. 이 프로토콜에서, V. fischeri 스트레인 ES114는 기준 균주로서 작용할 것이다.
2. 코인큐베이션에서 분리된 분리를 구별하기 위해 어떤 선택 및 스크리닝 방법을 사용할지 결정
   1. 전형적으로, 각 균주를 위해 선택하기 위하여 다른 항생 저항 유전자 (예를 들면 카나마이신 또는 클로람페니콜)를 포함하는 안정한 플라스미드를 가진 긴장을, 뿐만 아니라 다른 형광성 단백질 (예를 들면 GFP 또는 RFP)를 시각적으로 위해 칭하는 유전자를 선택합니다 공동 배양에서 균주 유형을 구별합니다.
      참고: 변형이 선택의 부재에서 플라스미드를 잃는 경우, 다음이 균주의 숫자는 정량화 할 때 과소 평가될 것이기 때문에 안정적인 플라스미드의 사용이 필요하며, 형광 현미경 을 사용하여 시각적으로 검출되지 않습니다.
   2. 태그 코인큐베이트 V. fischeri 균주는 하나의 균주가 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 항생제 카나마이신 (Kan R)에 대한 내성을 발현하는 플라스미드 pVSV102를 포함하고, 두 번째 균주는 두 번째 균주를 포함하도록 차별화 플라스미드 pVSV208은, 적색 형광 단백질(dsRed) 및 항생제 클로람페니콜(CmR)에 대한 내성을 발현한다(Cm R)^22.
      참고: 다른 차동 선택은 동전 균주를 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 추가 방법은 토론을 참조하십시오.
   3. 동전 분석법의 초기 최적화 동안 다음 제어를 포함하여 선택이 견고하도록 한다. 그것에 대하여 선택해야 하는 항생제를 포함하는 한천 판에 차별적으로 태그되는 각 스트레인 플레이트(즉, 변형균2를 선택하는 매체에 플레이트 스트레인 1, 그 반대의 경우도 마찬가지).
3. 동전 분석, 줄무늬 기준 변형pVSV102, 기준 균주 pVSV208, 및 각 경쟁사 균주 pVSV208 -80°C 에서 적절한 항생제를 함유하는 LBS 한천 플레이트에 pVSV208(예를 들어, 100 μg/mL 카나마이신 또는 2 μg/mL) 클로람페니콜)을 24°C에서 밤새 배양한다. 항생제 선택은 모든 세포가 실험의 시작 부분에 플라스미드를 포함되도록 하는 데 필요합니다.
4. 분석하기 하루 전에, 적절한 항생제와 함께 신선한 LBS 한천 접시에 균주 유형 (생물학적 복제)당 4 개의 개별 식민지를 선택하고 다시 24 °C에서 밤새 배양.
   참고: 이 단계는 관심 있는 유기체의 성장 속도에 따라 충분한 세포를 얻기 위해 더 길거나 짧은 배양 시간이 필요할 수 있기 때문에 다른 세균 종에 대한 최적화를 요구할 수 있다.

2. 코인큐베이트 세균균주

1. 배양을 위한 각 세균성 긴장의 준비(그림1A)
   1. 멸균 이쑤시개를 사용하여 한천 접시에서 세포를 긁어 내고 (쌀 알갱이 크기만큼) LBS 국물 1 mL을 포함하는 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에서 세포를 다시 일시 중단하십시오. 튜브의 측면으로 누르고 활발하게 위아래로 파이펫팅하여 세포 덩어리를 분해.
   2. 튜브와 소용돌이를 1-2 초 동안 캡하십시오. 셀 덩어리가 여전히 보이는 경우 샘플이 시각적으로 균일 할 때까지 위아래로 소용돌이 또는 파이펫을 계속하십시오.
   3. 모든 샘플에 대해 2.1.1-2.1.2 단계를 반복합니다.
2. 모든 시료에 대해 광학 밀도를 600nm(OD_600)로측정하고 기록합니다. 정확한 OD 측정을 위해 LBS 국물을 사용하여 샘플을 최대 10배까지 희석해야 합니다. 원하는 OD_600으로각 샘플을 정규화합니다. 균주는 전형적으로 OD_{600~1.0으로} 정규화되며, 이는 V. fischeri에대해 ~10⁶ 박테리아/mL로 변환됩니다.
   참고: 이 단계는 접종 세포 밀도가 경쟁의 메커니즘에 따라 코인큐브생성 결과에 영향을 미치기 때문에 상이한 세균 종에 대한 최적화를 요구할 수 있다. 최적화에 대한 토론을 참조하십시오.
3. 동전 균주(그림1B,C)
   1. 표지된 1.5 mL 원심분리튜브에 각 스트레인의 100 mL(OD 1.0으로 정규화)를 추가하여 기준 변형률과 경쟁균주를 1:1 비율(v/v)으로 혼합합니다. 컨트롤로서, 기준 스트레인을 차별화태그된 버전 자체(참조 스트레인 pVSV102 + 기준 변형변형 pVSV208)와 혼합한다. 이 제어는 경쟁 자 변형의 존재가 기준 변형의 성장에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 나중에 통계 분석에 필요합니다. 1-2s에 대한 혼합 스트레인 배양소용돌이.
      참고: 이 단계는 시작 비율이 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으며 조정해야 할 수 있기 때문에 최적화가 필요할 수 있습니다. 최적화에 대한 토론을 참조하십시오.
   2. 각 생물학적 복제에 대해 2.3.1 단계를 반복합니다. 이 단계를 완료 한 후, 8 개의 혼합 변형 튜브의 총이 있어야합니다 : 차별화 태그 참조 균주 (제어)와 네 개의 생물학적 복제, 차별화 태그 참조 및 경쟁 균주를 가진 네 개의 생물학적 복제 ( 실험).
   3. LBS 한천을 함유하는 페트리 플레이트에 각각의 대조군 및 실험혼합물의 10 mL을 스팟; 이러한 배양 반점은 배양 후 형광 현미경 검사법에 사용됩니다.
   4. 모든 액체가 한천에 흡수될 때까지 반점이 벤치에서 완전히 건조되도록 하고 24시간 동안 24°C에서 페트리 플레이트를 배양합니다. pVSV102 및 pVSV208로 태그가 지정된 V. fischeri 균주는 형광 해부 현미경을 사용하여 인구 수준에서 각각 GFP 및 RFP를 시각화하기에 충분한 세포 밀도로 성장하기 위해 최소 15회가 필요합니다. 여기에서, 우리는 화상 진찰 혼합 반점을 위한 24 시간 배양을 이용합니다.
      참고: 너무 촉촉하거나 너무 건조하지 않은 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 접시가 너무 습한 경우, 동전 반점은 한천 접시에 흡수되지 않습니다; 같은 날 부은 접시를 사용하지 마십시오. 플레이트가 너무 건조하면 한천 표면에 작은 파도나 균열이 형성되어 동전 반점이 불규칙하게 형성될 수 있습니다.
   5. 단계 2.3.3에서와 동일한 세균 현탁액을 사용하여, 각 대조군 및 실험 혼합물의 10 mL을 잘 당 LBS 한천 1 mL을 포함하는 24 웰 플레이트에 자리. 2.3.3 단계에서와 같이, 24 웰 플레이트의 한천에 적절한 수분을 가지고 있는지 확인하십시오. 반점이 완전히 건조되고 24 °C에서 5 시간 동안 배양하십시오. 이들 배양 스팟은 실험의 끝에 있는 각 균주에 대한 콜로니 형성 단위(CFUs)를 정량화하는데 사용될 것이다.
      참고: 개별 우물에서 성장을 위한 세균 성 현탁액을 발견하면 종료 시점에서 쉽게 재서스펜션할 수 있습니다. 이 단계는 24웰 플레이트를 사용하는 보다 경제적인 접근법으로서 정사각형 멸균 필터 조각을 사용하여 달성될 수 있다. 정사각형 멸균 필터 조각은 한천 플레이트에 배치할 수 있으며 각 실험 혼합물의 10 mL는 24웰 플레이트가 아닌 이러한 필터 위에 발견될 수 있습니다. 동전 화 시간 후, 필터는 1.5 mL 원심분리기 튜브로 이송될 수 있고 코인큐브 스폿은 와류 또는 위아래로 피펫팅하여 재중단될 수 있다. 5 시간 배양 시간은 V. fischeri 격리¹⁹사이 간 세균 살해를 검출하기에 충분합니다, 그러나, 이 동전 벌기 시간은 그밖 종 또는 경쟁적인 기계장치를 위해 더 짧거나 더 길어야 할 수도 있습니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
4. 접종을 시작하기 위한 직렬 희석
   1. 시작 동전 혼합물의 직렬 희석을 수행하려면 8 개의 열과 12 개의 행이 있도록 96 웰 플레이트90 °를 회전시면 됩니다. 각 행은 첫 번째 열에 희석되지 않은 혼합물의 샘플을 포함하고 행의 나머지 웰에 걸쳐 7개의 10 배 직렬 희석이 뒤따릅니다 (그림 2A).
   2. 변형률 ID, 복제 번호 및 시간(접종 시작 = T0)으로 각 행에 레이블을 지정합니다. 희석 시리즈를 발견할 수 있는 적절한 항생제로 보충된 LBS 한천 플레이트에 라벨을 붙입니다. 각 항생제 판이 선택하는 균주를 확인하십시오.
   3. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 180 mL의 LBS 국물을 추가하고 원액 동전 혼합물에 대한 첫 번째 열을 비워 둡니다.
      참고: 연구원은 특히 빠르게 성장하는 세균 종으로 작업하거나 직렬 희석이 걸릴 수 있습니다 큰 실험을 수행하는 경우 인산완충 식염수 (PBS)를 사용하여 동전 반점을 다시 중단하고 직렬 희석을 수행 하도록 선택할 수 있습니다. 오랜 시간 동안 수행 할 수 있습니다. 이러한 경우에 PBS를 사용 하 여 직렬 희석을 수행 하는 과정에서 박테리아의 상당한 발생을 방지할 것 이다. 그러나 크기 나 기간에 관계없이 모든 실험에서 사용되는 솔루션(예: PBS 또는 LBS)과 일관성을 유지해야 합니다.
   4. 200 mL 단일 채널 파이펫을 사용하여, 튜브로부터 제1 컬럼으로 100 mL의 코인큐베이션 혼합물을 잘 이송한다. 팁을 버리고 모든 동전 혼합물에 대해 반복하십시오.
   5. 멀티채널 파이펫을 사용하여 기둥 1에서 2로 20mL를 전송하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다. 팁을 버리고 각 열에 대해 반복하여 각 행에 초기 동전 혼합물의 10 배 직렬 희석이 포함되어 있습니다.
      참고: 희석이 위아래로 피펫처리되는 횟수와 일치합니다. 예를 들어, 각 희석에 대해 파이펫 핸들을 5회 누르고 희석 계열 전체에서 일관되게 합니다.
   6. 8개의 팁이 장착된 멀티채널 파이펫을 사용하여 희석 시리즈(즉, 8개의 우물 의 한 행)에서 각 우물에서 5mL를 흡인하고 참조 변형을 선택하는 LBS 한천 플레이트에 스폿을 놓습니다(카나마이신으로 보충). 이 단계를 반복하여 경쟁균주에 대해 선택된 플레이트에 스포팅(클로람페니콜보충제)(그림2B)을반복한다. 인큐베이터에 넣기 전에 반점이 완전히 건조되도록 하십시오.
      참고: 동일한 팁은 참조 및 경쟁 자 변형을 위해 선택된 플레이트에서 복제 희석 계열을 스크리처하는 데 사용될 수 있지만 복제 사이에 변경되어야 합니다. 이 세균 식민지를 닮은 우울증을 만들 수 있으며 플레이트 카운트 동안 결과를 왜곡 할 수 있기 때문에 LBS 한천 접시에 파이펫 팁의 끝을 만지지 마십시오. 팁이 접시를 만지면 메모를하고 식민지 수에 우울증을 포함하지 마십시오.
5. T 최종 측정
   1. 24웰 플레이트의 코인큐베이션 스팟을 24°C에서 5시간 동안 배양한 후, 각 웰에 1 mL의 LBS 국물을 추가하고 모든 세포가 다시 중단될 때까지 위아래로 파이펫팅하여 코인큐베이션 스팟을 다시 중단합니다. 세포가 모든 복제에 걸쳐 다시 일시 중단되는 활력과 일치합니다. 예를 들어 파이펫 핸들을 8번 누르고 각 샘플을 완전히 다시 일시 중단합니다.
   2. 각 코인큐브 스팟이 재중단되면, 2.4.1단계와 같은 방식으로 희석을 스니치하는 적절한 항생제로 직렬 희석 및 LBS 한천 플레이트를 위한 96웰 플레이트를 준비한다.
   3. 2.4.2-2.4.6 단계를 수행하여 T 최종 측정을 위한 직렬 희석을 완료합니다.
      참고: 중요한 대조군은 동전 분석법의 초기 최적화 동안 포함되어야 한다. 동전 배기 기간의 끝에서, 혼합 된 균주를 두 항생제를 포함하는 매체에 플레이트. 1) 자발적인 돌연변이가 발생하거나 2) 선택 가능한 마커가 균주 간에 교환되지 않는 한 어느 균주도 성장할 수 없습니다.

3. 형광 현미경 을 사용하여 동전 을 시각화

1. LBS 한천 페트리 플레이트상에서 각각의 코인큐베이션 스팟은 안정한 플라스미드 상에서 발현되는 형광 단백질에 대응하는 녹색 및 적색 형광 검출을 위해 장착된 스테레오 현미경을 사용하여 2.3.3 단계 및 2.3.4 단계에서 의한 각 동전 방출 스팟을 사용한다.
2. 먼저 제어 코인큐브 스팟(참조 변형률 pVSV102 + 기준 변형률 pVSV208)의 이미지를 촬영합니다.
   1. 자리가 초점에 맞춰지 않도록 배율을 조정합니다.
   2. GFP를 관찰하기 위해 적절한 여기 빛과 필터를 사용하여, 코인큐베이션 스팟에서 단지 형광이 검출가능하고 매체에서 어떤 배경 형광이 낮거나 보이지 않도록 노출 시간을 조정합니다.
   3. 여기 빛과 필터를 변경하여 RFP를 관찰하고 노출 시간을 조정하여 매체의 배경을 최소화합니다.
3. 실험 적 치료로부터의 각 코인큐베이션 스팟에 대해, GFP 필터를 이용한 기준 균주에 대한 이미지 및 3.2.2단계에서 결정된 노출 시간.
4. RFP 필터를 사용하여 경쟁사 균주를 이미지화하고, 배지로부터의 코인큐베이션 스폿 및 배경 형광으로부터만 형광이 관찰되도록 노출 시간을 조정하는 것은 최소한의 양세이다. 두 이미지를 저장하고 이를 모두 저장하여 스트레인 아이디, 복제 번호, 이미지를 촬영한 인큐베이션 시간(예: 24시간)을 모두 포함합니다. 모든 복제에 대해 반복합니다.
   참고: 코인큐베이션 시간은 다른 플라스미드 또는 세균 종에 대해 조정되어야 할 수도 있다. 최적화에 대한 토론을 참조하십시오.

4. 데이터 분석

1. 각 시점에서 각 제어 및 실험 치료에 대한 CFUs 계산(T 시작 및 T 최종)
   1. 일단 콜로니가 직렬 희석 판(예를 들어, V. fischeri의경우 24°C에서 24시간)에 표시되면, 개별 콜로니가 계산될 수 있고 큰 다중 콜로니 클러스터로 함께 성장하지 않은 희석 계수를 식별합니다(그림2B). 각 복제에 대해 지정된 희석에 대한 개별 콜로니 수를 계산하고 기록합니다. 이 숫자는 해당 복제에 대한 CFU를 나타냅니다.
   2. 희석에 대한 CFU를 아래 수식을 사용하여 코인큐베이션의 각 균주에 대한 총 CFUs로 변환합니다.
      [ 희석점의 CFUs (희석인자 x vol.) x vol. 희석되지 않은 시료 = 총 CFU
      예: T0: [(6 CFUs) ́ (10^-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 실험 시작 시 혼합 스팟에서 변형률 1의 총 CFU 1.2E7
      T5: [(4 CFUs) ́ (10^-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 5 시간 동전 방합 후 혼합 스팟에서 변형 1의 총 CFUs 8.0E5
      각 스트레인의 CFU 값은 여러 가지 분석 및 통계 테스트에 사용할 수 있는 원시 데이터입니다(아래 섹션 4.2 참조).
2. 다음 데이터 변환을 수행하여 경쟁 업체 변형이 기준 변형을 능가하는지 여부를 결정합니다: (i) 경쟁 스트레인의 존재 에서 기준 변형의 비율이 감소하는지 여부를 결정하거나 (ii) 상대적 경쟁 지수(RCI)를 기록할 수 있습니다. 이러한 분석은 원시 데이터를 비율로 변환하고 상호 작용의 경쟁 결과를 결정하는 데 유용할 수 있지만 경쟁 메커니즘(즉, 살인 대 성장 억제)을 결정할 수는 없습니다.
   1. 코인큐베이션 동안 각 시점에 대한 각 스트레인의 비율 계산
      1. CFU 데이터를 치료에서 각 균주의 비율로 변환합니다. T0의 기준 변형률(RS)의 경우 T0의 기준 변형률에 대한 총 CFU를 T0의 기준 변형률에 대한 총 Cfu와 T0의 경쟁자(CS)의 합계로 나눕니다.
         RS_T0 CFUs  (RS_T0 CFUs + CS_T0 CFUs) = T0에서 기준 변형률의 비율.
         동일한 계산을 수행하여 T0에서 경쟁 업체 변형률의 비율을 결정합니다.
         CS_T0 CFUs  (RS_T0 CFUs + CS_T0 CFUs) = T0에서 기준 변형률 비율
         각 시점마다 이 과정을 반복하고 실험 적 치료 및 대조군 치료 모두에 대해 복제한다(차별화태그가 붙은 기준 변형균주 동전).
      2. 누적 막대 그래프(그림 3A)에서 T0 및 T5의각 변형유형의 평균 비율을 그래프로 표시합니다.
      3. 균주의 원하는 시작 비율을 수득되었는지 확인합니다. 균주가 처음에 1:1을 혼합한 코인큐베이션의 경우, 각 균주 유형은 T0에서 인구의 ~0.5를 포함해야 하며 학생의 T-test(P > 0.05)를 사용하여 서로 통계적으로 달라서는 안 됩니다. 한 균주의 비율이 T0의 다른 균주보다 훨씬 큰 경우 1:1 시작 비율이 달성될 때까지 실험을 반복합니다.
      4. 경쟁 균주가 5 시간 후에 인구의 상당히 더 큰 비율을 포함하는지 여부를 결정합니다. T0 및 T5에서 실험 적 치료에서 각 균주의 비율을 비교하는 학생의 t 테스트를 수행합니다. 경쟁 균주의 비율이 T5(P < 0.05)의 기준 변형률과 크게 다른 경우, 이 결과는 변형 경쟁이 발생했을 수 있음을 시사한다. 4.2.1.5 단계로 진행합니다.
      5. 경쟁 균주의 존재가 5 시간 후에 기준 변형의 비율을 감소했는지 여부를 결정하기 위해, 대조군에서 기준 변형률의 비율을 비교하는 학생의 t 테스트를 수행하고 실험 적 치료 (기준 변형 v 경쟁 변형).
         참고 : 기준 균주의 비율이 대조군(P < 0.05)에 비해 실험 치료에서 통계적으로 낮은 경우, 경쟁 균주는 5 시간 후 기준 균주의 비율을 현저히 감소시키고 기준 변형률을 능가했습니다.
   2. 각 치료에 대한 로그 RCI 값 계산(컨트롤 포함)
      참고: 상대적 경쟁 지수(RCI)는 변형률 유형의 종단 비율이 시작 비율과 어떻게 다른지 비교하는 단일 값입니다. RCI 값은 로그 변환되어 로그 RCI 값이 0보다 큰 로그 RCI 값이 경쟁자 변형(CS)이 기준 변형률(RS)을 능가하고, 로그 RCI 값이 0보다 작다는 것은 경쟁자 변형을 능가하는 기준 스트레인을 나타내고, 로그 RCI가 경쟁자 변형을 능가하는 것을 나타냅니다. 값이 0이면 어느 스트레인도 경쟁하지 않았다는 것을 나타냅니다.
      1. 다음 방정식을 사용하여 각 제어 및 실험 처리에 대한 로그 RCI 값을 계산합니다.
         로그 [(CS_T5 CFU+ RS_T5 CFUs)
      2. 그래프 로그 RCI 값은 분리된 상자 및 수염 플롯을 사용하여 데이터가수평 방향으로 그래프화됩니다(그림 3B).
      3. 각 치료의 로그 RCI 값(대조군 포함)을 동일한 수의 복제수를 0 값으로 비교한 데이터 세트와 학생의 t-test를 비교하여 각 치료가 0과 크게 다른지 여부를 결정합니다. 실험 적 치료에 대한 로그 RCI 값이 통계적으로 0(P < 0.05)보다 큰 경우, 경쟁 균주는 기준 변형을 능가합니다.
         참고: 대조군이 0(P > 0.05)과 통계적으로 다르지 않아야 하는데, 이는 차별화된 참조 균주가 등소성이기 때문이다.
      4. 실험적 치료에 대한 로그 RCI 값이 대조군(P < 0.05)보다 훨씬 큰지 여부를 결정하기 위해 학생의 t-검정을 수행한다. 실험적 치료로부터의 로그 RCI 값이 대조군 처리보다 통계적으로 큰 경우, 경쟁균주는 기준 균주를 능가한다.
3. 다음 통계 분석을 수행하여 경쟁 업체 변형이 기준 변형을 능가하는 메커니즘을 결정합니다: (i) 원시 총 CFU 데이터를 분석하거나 (ii) 기준 변형률의 백분율 복구를 검사합니다. 이러한 분석은 4.2단계에서 의한 것들을 기준으로 보는 것이 더 번거로울 수 있지만, 경쟁사 스트레인이 기준 스트레인을 성장시키고, 기준 변형률 성장을 억제하거나, 기준 변형률을 적극적으로 제거함으로써 기준 변형을 능가하는지 여부를 식별할 수 있습니다.
   1. 원시 총 CFU 데이터 분석
      1. 인터리브 란터 플롯을 사용하여 두 균주에 대한 원시 총 CFU 데이터를 그래프로 표시하고 복제는 개별 데이터 포인트로 표시됩니다(그림4A). 로그 축척에 데이터를 표시하고 두 균주에 대한 평균 T0 CFUs를 나타내는 수평 선을 추가합니다.
      2. 경쟁 균주의 존재가 기준 균주에 부정적인 영향을 미치는지 여부를 확인하려면 T5에서 제어 및 실험 치료에 대한 참조 변형 CFUs를 비교하는 학생의 t 테스트를 수행합니다. 실험 적 치료에서 기준 균주 CFUs가 대조군(P < 0.05)보다 통계적으로 낮은 경우, 경쟁 균주의 존재는 기준 균주에 크게 영향을 미쳤다.
      3. 경쟁 균주의 존재가 기준 균주의 성장을 억제하거나 제거했는지 여부를 결정하기 위해, 제어 및 실험 적 치료에 대한 T0 및 T5에서 기준 변형 CFUs를 비교하는 학생의 t 테스트를 수행합니다.
         참고: 경쟁자가 없는 경우, 대조군 치료를 위한 T0 및 T5를 비교할 때 기준 균주는 CFU에서 유의한 증가를 나타내야 한다. 실험적 치료를 분석할 때, T5에서의 기준 균주 CFUs가T0(P> 0.05)에 비해 통계적으로 다르지 않은 경우, 이어서 경쟁균주는 기준 균주의 성장을 억제하였다. 기준 변형률 T5 CFUs가 T0CFUs(P< 0.05)보다 현저히 낮은 경우, 경쟁 균주는 기준 변형을 죽였습니다.
   2. 기준 변형률의 백분율 복구 계산
      1. 아래 방정식을 사용하여 기준 변형률(RS)에 대한 총 CFU 데이터를 백분율 복구 데이터로 변환합니다.
      2. (RS_T5 CFUs ́ RS_T0 CFUs) x 100 = 기준 변형률 % 회수
      3. 각 막대가 대조군 또는 실험적 처리를 나타내는 분리된 막대 그래프를사용하여 기준 변형률의 백분율 복구를 표시합니다(그림 4B). 참조 변형률의 100% 복구를 나타내기 위해 y = 100에서 파선 선을 추가합니다(0시간에서 5시간까지 참조 변형 CFUs의 증가 또는 감소 없음).
      4. 경쟁 균주가 기준 균주에 부정적인 영향을 미치는지 여부를 확인하려면, 실험 치료에 대한 대조군 치료에 대한 기준 변형률 %의 회복을 비교하는 학생의 t 테스트를 수행한다. 백분율 회수가 대조군(P&0.05)보다 현저히 적으면 경쟁 균주가 기준 변형에 부정적인 영향을 미칩니다.
      5. 경쟁 균주가 기준 균주의 성장을 억제하거나 제거했는지 여부를 식별하려면 실험 치료에 대한 기준 변형률 백분율 복구를 비교하는 학생의 t 테스트를 수행하고 동일한 수의 복제물로 데이터 세트를 수행합니다. 값 100입니다.
         참고: 실험적 치료가 100(P> 0.05)과 통계적으로 다르지 않은 경우, 경쟁균주는 기준 균주의 성장을 억제하였다. 실험 적 치료에서 기준 균주 퍼센트 회수가 100 (P< 0.05)보다 현저히 낮은 경우, 경쟁 균주는 기준 균주를 죽였다.
   3. 형광 현미경 이미지 해석
      1. 형광 현미경 이미지가 촬영되면, 각 균주가 동전 지점에서 눈에 띄게 검출 가능한지 여부를 결정합니다. 제어 코인큐브(기준 변형변형pVSV102 + 기준 변형변형pVSV208)의 경우, GFP와 RFP는 모두 하나의 코인큐베이션 스팟에서 볼 수 있어야 한다. 그렇지 않은 경우, 균주가 항생제없는 접시에 제대로 표지되고 동전화되도록 실험을 다시 설정하십시오.
      2. 각 실험 코인큐브 스팟에 대해 가능한 결과를 확인하십시오.
         참고: 경쟁 기 변형이 표시되지만 기준 변형이 검출되지 않는 경우, 이는 경쟁자 변형이 기준 스트레인의 성장을 죽이거나 억제했음을 시사한다. 두 균주가 존재하고 균일하게 혼합된 경우(동전 배합 지점에 걸쳐 GFP 및 RFP 존재), 이러한 데이터는 경쟁 균주가 기준 균주와 경쟁하지 않고 두 균주가 공존하는 것을 시사한다. 두 균주가 존재하지만 공간적으로 분리된 경우(GFP 또는 RFP의 마이크로콜로니는 코인큐베이션 스폿 전체에 존재함), 기준 균주와 경쟁사 균주가 경쟁적인 상호 작용 및 변형에 관여할 수 있음을 시사합니다. 기준 변형또는 초기 코인큐베이션 비율이 필요할 수 있다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.

5. 상호 작용이 접촉 의존적인지 여부 결정

참고: 하나의 스트레인이 기준 변형을 죽이거나 억제하는 것을 발견하면 상호작용이 확산가능하거나 접촉에 의존적일 수 있습니다. 상호작용이 세포-세포 접촉에 의존하는지 여부를 결정하기 위해, 다음 의 변형을 가진 단계 1-2에 대해 전술한 바와 같이 동전 분석기를 수행한다.

1. 단계 1.1-2.2를 수행합니다.
2. 균주가 정규화되면 0.22 mm 기공 크기의 니트로 셀룰로오스 필터를 사용하여 균주를 물리적으로 분리합니다. 이 공극 크기는 항균제와 작은 분자의 확산을 허용하지만 V. fischeri 세포 사이의 물리적 접촉을 방지합니다.
   참고: 상호작용이 세포-세포 접촉에 의존하는 경우, 경쟁균으로부터 기준 균주를 필터와 분리하여 살인 또는 억제 표현형을 폐지해야 하며 기준 균주는 CFU를 감소시키지 않아야 한다. 상호작용이 세포-세포 접촉에 의존하지 않고, 확산 성 메커니즘인 경우, 균주를 분리하는 것은 경쟁균이 기준 균주를 죽이는 것을 방지해서는 안 된다.
   1. 기준 스트레인의 5 mL을 필터의 중심에 놓고 경쟁업체 의 스트레인을 다른 필터의 중심에 5 mL 를 스폿합니다. 참조 변형이 포함된 필터를 LBS 한천 플레이트의 표면에 놓습니다. 경쟁 업체 변형이 포함된 필터를 참조 변형이 있는 필터 바로 위에 놓습니다.
      참고: 각 균주는 균주가 더 쉽게 서로의 상단에 직접 배치 할 수 있도록 한천 접시에 직접 발견 바닥 변형보다는 필터에 발견된다.
   2. 균주가 서로의 상단에 직접 적층되지 않는 우려가있는 경우, 필터에 발견 기준 변형 접종의 볼륨을 감소. 이렇게 하면 기준 스트레인 스폿의 면적이 더 작고 완전히 경쟁기 스트레인 위 또는 아래에 있습니다. 한천 배지에서 영양소의 확산의 차이를 고려하기 위해 상단과 하단에 있는 균주가 대체됩니다.
   3. 필터가 소분자의 확산을 허용하도록 하기 위해, 기준 균주가 필터상에 발견되는 제어 처리를 포함하고 다른 것으로는 민감성(클로람페니콜)에 민감한 항생제를 포함한다. 필터를 서로 바로 겹치게 쌓고 LBS 한천 접시에 놓습니다. 항생제는 필터를 통해 확산 할 수 있어야하고 기준 변형을 죽여야한다.
3. 5 시간 동안 24 °C에서 필터로 플레이트를 배양하십시오. 필터를 이동하지 않도록 배양 할 때 한천 판을 반전시키지 마십시오.
4. 단계 2.4에 따라 시작 접종에 대한 직렬 희석을 수행합니다.
5. T 최종 측정
   1. 멸균 핀셋을 사용하여 각 필터 세트를 LBS 국물 5mL가 들어 있는 50mL 팔콘 튜브로 옮김. 각 변형 유형의 전체 재현탁액을 허용하기 위해 필터가 튜브 내에서 물리적으로 분리되어 있는지 확인합니다.
   2. 필터가 모든 셀의 명확한 때까지 위아래로 파이펫팅하여 필터에서 균주를 다시 일시 중단합니다. 핀셋을 사용하여 필터를 회전시키고 양쪽에서 셀 재질을 지웁돌십시오. 샘플 사이에 에탄올로 핀셋을 살균하십시오.
   3. 2.5단계에 따라 T 파이널에 대한 직렬 희석을 수행합니다. T 파이널에 대한 총 CFU를 계산할 때 "원액 샘플의 총 부피"를 1mL에서 5mL로 조정합니다.

Results

세균 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 평가하기 위해, 동전 분석 프로토콜이 개발되고 V. fischeri에최적화되었다. 이 방법은 항생 저항 유전자 및 형광 성 단백질을 인코딩하는 안정한 플라스미드를 활용하여 각 균주의 차등 선택 및 시각적 차별을 허용합니다. 동전 분석에서 수집된 데이터를 분석함으로써, 상호작용의 경쟁적 결과 및 상호작용의 메커니즘을 식별할 수 있다. 일례로, 다음의 실험은 V. fischeri 분리체를 사용하여 수행하였다. 동전 균주는 두 개의 안정적인 플라스미드 중 하나를 품고 있었다: pVSV102 카나마이신 저항 및 GFP +를 표현, 또는 pVSV208 클로람페니콜 저항 및 DsRed +를 표현. 샘플 데이터에서, 균주는 1:1 비율로 혼합하고 LBS 한천 플레이트에서 5시간 동안 배양하였다. 대조군 처리로서, 기준 균주의 차별화태그된 버전을 서로 코인큐베이팅하였다. 실험적 처리는 기준 균주(항만 pVSV102)...

Discussion

전술한 코인큐브레이션 분석법은 박테리아 간 경쟁을 발견할 수 있는 강력한 방법을 제공한다. 이러한 접근법은 V. fischeri 격리 및 경쟁 메커니즘의 특성화 사이의 특정 경쟁의 식별을^허용19. 기재된 방법은 해양 균 V. fischeri에최적화되었지만 임상 및 환경 분리를 포함한 다른 세균 종을 수용하기 위해 용이하게 변형될 수 있다. 경쟁 메커니즘은 종종 조건부 5, 6^{,23,24,25,26,27} 규제된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher	05-408-129
10 μ L 멀티채널 피펫
100 μ L 멀티채널 피펫
300 μ L 멀티채널 피펫
10 μ L 싱글 채널 피펫
20 μ L 싱글채널 피펫
200 & L 싱글채널 피펫
1,000 μ L 단일 채널 피펫
24웰 플레이트	Fisher	07-200-84	멸균(뚜껑 포함
96웰 플레이트	VWR	10062-900	멸균(뚜껑 포함
계산기
Chloramphenicol	Sigma	C0378	스톡(에탄올 중 20mg/mL);매체의 최종 농도(2 μ g/mL LBS)카메라
및 이미징 소프트웨어를
집게	Fisher	08-880
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL in water, filter sterilize);매체 내 최종 농도 (1 μ g/mL LBS)
니트로셀룰로오스 멤브레인(FS MCE, 25MM, NS)	피셔	SA1J788H5	0.22 μ m 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (pk of 100)
페트리 플레이트	Fisher	FB0875713	뚜껑이있는 멸균
분광 광도계
세미 마이크로 큐벳	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 μ L 스타터 시스템	USA Scientific	1111-3500	10 랙
TipOne 200 μ L 스타터 시스템	USA Scientific	1111-500	10 랙
TipOne 1000 μ L 스타터 시스템	USA Scientific	1111-2520	10 랙
Vortex
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
LBS media
1 M 트리스 버퍼 (pH ~7.5)			50 mL 1 M 스톡 버퍼(62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (플레이트에만 추가)
DI water			950 mL
염화나트륨	Fisher	S640-3	20 g
트립톤	Fisher	BP97265	10 g
효모 추출물	Fisher	BP9727-2	5 g