우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
선형 mRNA 이외에, 많은 진핵 유전자는 원형 RNA를 생성합니다. 대부분의 원형 RNA는 5' 스플라이스 사이트와 사전 mRNA 내의 스플라이스 사이트, 백 스플라이싱이라는 프로세스를 결합하여 생성됩니다. 이 순환은 스플라이스 사이트를 근접으로 가져오는 pre-mRNA에 있는 이차 구조물에 의해 아마 원조됩니다. 인간 유전자에서, Alu 요소는 이러한 이차 RNA 구조를 촉진하는 것으로 생각된다, 알루 요소는 풍부하고 사전 mRNA에서 반대 방향으로 존재 할 때 서로 기본 상보성을 전시. 여기서, 우리는 원형 RNA를 형성하는 리포터 유전자를 포함하는 큰, Alu 요소의 생성 및 분석을 기술한다. 복제 프로토콜의 최적화를 통해 최대 20kb 의 삽입 길이의 리포터 유전자를 생성할 수 있습니다. 공동 형질감염 실험에서의 분석을 통해 규제 요인을 식별할 수 있습니다. 따라서, 이 방법은 원형 RNA 형성에 관여하는 RNA 서열 및 세포 성분을 식별할 수 있다.
서론
원형 RNA
원형 RNA (circRNAs)는 대부분의 유기체에서 발현되는 공유폐쇄된 단일 가닥 RNA입니다. 이들은 다운스트림 5' 스플라이스 사이트를 업스트림 3' 스플라이스 사이트로 결합하여 생성되며, 백스플라이싱(그림1A)이라고불리는 프로세스입니다. 30-40 nt만큼 짧은 염기 상보를 나타내는 pre-mRNA의 서열은 circRNA 형성을 위한 적당한 정렬로 역 스플라이스 사이트를가져온다 2. 인간에서, 알루 원소1은,게놈3의약 11%를 나타내며, 그들의 자기 상보성4,5로 인해 pre-mRNA에서 광범위한 이중 좌초 RNA 구조를 형성하고 따라서 circRNAs1의형성을 촉진한다.
현재, circRNAs의 3개의 중요한 기능은 기술되었습니다. 일부 circRNAs 는 miRNA (mi....
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프로토콜
1. 구문 설계
- UCSC 게놈 브라우저24를 사용하여 원형 RNA 형성에 필요한 반복적 요소를 식별하고 이를 구성에 통합합니다. 중요한 것은, 증폭을 위한 프라이머는 반복적인 요소 외부에 있어야 합니다.
- 원형 RNA 서열(보충도1은 시험 서열)을 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start 넣고 올바른 유기체를 선택한다. 시퀀스를 제출하고 브라우저 보기로 이동하여 1.5배 또는 적절하게 축소합니다(그림2A).
참고: 검색 순서가 맨 위 줄에나타납니다(그림 2A, 1). 원형 RNA의 엑온의 순서에 따라 BLAT는 모든 엑소온을 연결하지 않습니다. 이 예에서, 엑온12(도 2A, 4)는11에 연결되지 않음(도 2A, 2, 3....
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결과
리포터 유전자는 원형 RNA 형성에 영향을 미치는 규제 요인의 결정을 허용합니다. 그러나, 이 리포터 유전자는 크고 수시로 DNA 구조물을 불안정하게 하는 반복적인 요소를 포함합니다. 큰 크기로 인해 종종 엑손과 작은 측면 내향성 부품을 포함하는 게놈 조각을 증폭시킴으로써 달성되는 인트론의 일부를 삭제해야합니다. 이 DNA 조각은 효소로 조립되어 제한 효소없이 시공할 수 있습니다.
마이크로투튜불 관련 단백질 타우(MAPT)로부터 생성된 원형 RNA의 예는 원형 RNA를 분석하기 위한 미니유전자 접근법의 적용을 나타낸다. 본 예에서 사용된 타우 9→12 미니유전자는 상이한 접합 인자로 공동 형질감염되었고 이러한 접합 인자의 효과는 RT-PCR에 의해 검출되었다(도6). 상이한 트랜스-행동 인자는 원형 RNA 및 선형 pre-mRNA 형성 둘 다에 영향을 미칩니다. 실험은 또한 원형 RNA 형성에 필요한 모든 서열 요소가 복제 된.......
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토론
일반적으로 원형 RNA는 낮은 풍부한1이며,이는 그들의 기능과 형성에 대한 연구를 복잡하게합니다. 선형 RNA13과유사하게, 리포터 미니유전자의 사용은 원형 RNA의 형성을 통제하는 시스 및 트랜스 행동 인자의 식별을 허용합니다. 따라서, 이 접근은 내인성 유전자를 사용하여 추가로 시험될 수 있는 가설을 생성합니다.
가장 중요한 단계는 리포터 유전자의 설계입니다. DNA 단편의 효소 조립 ("깁슨복제"27)은제한 부위와 무관한 대형 리포터 유전자의 구성을 허용하기 때문에이 설계를 용이하게합니다.
백 스플릿 사이트는 기자 유전자 구성에서 고려해야 할 측면 반전 반복을 통해 함께 가져온다. 반복은 게놈 브라우저 '반복 트랙'에 추가되고 이를 선택하면 방향이 표시됩니다. 단백질은 또한 원형 RNA 발현
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공개 사항
공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국방부 국방부 보조금 AZ180075에 의해 지원되었다. 스테판 스엠 감사 재클린 누난 엔다우먼트. 안나 PawluchinD에 의해 지원되었다, 독일의 학술 교류 프로그램, 저스틴 R. 웰던 켄터키 맥스 Steckler 상 대학의 수상자였다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| 빌더 도구 | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| 효소 DNA 조립 키트 | NEB | E2621S | |
| 젤 및 PCR 클린업 키트 | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 클로닝 사이트 | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| 중합효소 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA 중 |
| 합효소 중합효소 2 | Biorad | 1725310 | 장거리 중합효소(NEB), iproof(BioRad) |
| 중합효소 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen 장거리 중합효소 키트 |
| 역전사효소 | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA 분리 키트 | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| 안정된 유능 세포 | NEB | C3040H | NEB 안정 세포 |
| 표준 복제 박테리아 | NEB | C2988J | NEB5-alpha 유능한 |
| 웹 도구 프라이머 설계 | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| 웹 기반 온도 계산 | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
참고문헌
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P.
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재인쇄 및 허가
