쥐 대뇌 피 질의 혈관 구조에서 염료의 세척 및 세척을 모니터링 하기 위한 펄스 레이저 다이오드 기반 데스크탑 광 음향 단층 촬영

광 음향 계산 단층 촬영 (계약/PAT)은 높은 초음파 해상도^1,2,³ 과 풍부한 광학 콘트라스트를 결합 하는 유망한 비 침 습 적 생물 의학 이미징 양상입니다. ⁵. 나노초 펄스 레이저는 생체 조직 내부에 존재 하는 빛을 흡수 하는 발 색 광에 에너지를 침전 하는 경우, 국부 적으로 온도 증가 조직의 열 탄성 팽창 및 수축으로 이어지는, 생성의 결과 압력 파도. 이 압력 파는 샘플 주위의 초음파 트랜스듀서에 의해 검출 될 수 있는 초음파 파 또는 광 음향 (PA) 파도로 알려져 있습니다. 검출 된 pa 신호는 다양 한 재구성 알고리즘 (⁶,⁷,^8,9 )을 사용 하 여 재구성 되어 단면 PA 이미지를 생성 한다. PA 이미징은 신체 내부에 존재 하는 내 인 성 발 색 단에 대 한 파장 의존성으로 인해 거시적 기관에서 현미경 소기관에이르기까지 구조적이 고 기능적인 정보를 제공 합니다. PAT 화상 진 찰은 유방암 검출에 성공적으로사용 되어 왔으며, 센 티 넬 림프절 이미징 (¹¹)은 산소 헤모글로빈 (HbO₂), deoxyhemoglobin의 매핑, 총 헤모글로빈 농도 (hbr), 산소량 포화 ₂) ^{12 ,} ( ¹³) 종양 맥 관 형성¹⁴, 작은 동물 몸 전체 영상 (¹⁵) 및 기타 용도.

Nd: YAG/OPO 레이저는 작은 동물 화상 진 찰과 깊은 조직 화상 진 찰¹⁶를 위한 광 음향 공동체에서 널리 이용 되는 1 세대 PAT 체계를 위한 전통적인 여기 근원입니다. 이 레이저는 ~ 10-100 Hz의 낮은 반복 속도로 ~ 100 mJ 에너지 펄스를 제공 합니다. 이러한 비용이 많이 들고 부피가 큰 레이저를 사용 하는 PAT 이미징 시스템은 펄스 반복률이 제한 되어 단일 요소 초음파 트랜스듀서 (SUTs)가 있는 고속 이미징에는 적합 하지 않습니다. 이는 동물 내부의 고속에서 발생 하는 생리 적 변화의 실시간 모니터링을 억제 합니다. 선형, 반원형, 원형 및 체적 배열과 같은 어레이 기반 트랜스듀서를 Nd와 함께 사용: YAG 레이저 여기, 고속 이미징이 가능 합니다. 그러나 이러한 어레이 트랜스듀서는 비용이 많이 들며 SUTs에 비해 낮은 민감도를 제공 합니다. 그러나 이미징 속도는 레이저의 낮은 반복 속도에 의해 제한 됩니다. 맞춤형 풀 링 어레이 트랜스듀서를 사용 하는 최첨단 싱글 임펄스 팩트 시스템은 50 Hz 프레임 레이트¹⁷에서 PA 데이터를 얻습니다. 이 어레이 트랜스듀서는 복잡 한 백엔드 수신 전자 장치 및 신호 증폭기가 필요 하므로 임상 사용을 위해 전체 시스템을 더 비싸고 어렵게 합니다.

컴팩트 한 크기, 낮은 비용 요구 사항 및 더 높은 펄스 반복 속도 (KHz의 순서)는 실시간 이미징에 대 한 더 유망한 펄스 레이저 다이오드 (PLDs)를 만든다. 이러한 장점으로 인해 PLDs는 2 세대 PAT 시스템에서 대체 여기 소스로 적극적으로 사용 됩니다. Pld 기반 PAT 시스템은 어레이 트랜스듀서를 이용한 하이 프레임 레이트 이미징에 성공적으로 입증^{되었습니다 18}, 심부 조직과 뇌 이미징¹⁹,²¹, 심혈 관 질환 진단²² , 류 마티스 진단²³. SUTs는 어레이 트랜스듀서에 비해 매우 민감하고 비용이 적게 들기 때문에 여전히 PAT 이미징에 광범위 하 게 사용 됩니다. 팬텀 이미징²⁴를 위해 파이버 기반 pld 시스템이 시연 되었습니다. 이전에는 PAT 스캐너 (²⁵) 내부에 pld를 장착 하 여 휴대용 pld-PAT 시스템을 시연 했습니다. 1 개의 숫 양의 원형 스캐너로, 팬텀 이미징은 스캔 시간 3 초 동안 수행 되었고, 생체 내 쥐 뇌 이미징은 PLD-PAT 시스템 (¹⁹)을 사용 하 여 5 s 기간 동안 수행 되었다.

또한 pld-PAT 시스템을 개선 하 여 더욱 콤팩트 하 게 만들고 8 개의 어쿠스틱 리플렉터 기반 단일 요소 초음파 트랜스듀서 (sutrs)^26을사용 하 여 데스크탑 모델을 제작 했습니다. 여기서, SUTs는 90^° 음향 반사 기 (²⁸)의 도움으로 수평 방향 대신 수직으로 배치 되었다. 이 시스템은 최대 0.5의 스캔 시간 및 ~ 3cm 깊이의 조직 이미징 및 생체 내 작은 동물 뇌 이미징에 사용 될 수 있습니다. 이 작업에서이 데스크탑 PLD-PAT 시스템은 작은 동물의 생체 내 뇌 이미징을 위한 실험의 시각적 시연과 식품 의약품 안전 청의 통풍 관 및 통관 과정의 동적 시각화를 위해 사용 됩니다 (FDA) 승인 indocyanine 녹색 (ICG) 쥐의 뇌에 염료.

모든 동물 실험은 싱가포르 난 양 기술 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 가이드라인 및 규정에 따라 수행 하였다 (동물 프로토콜 번호 ARF-SBS/A0331).

1. 시스템 설명

1. PLD 레이저를 원형 스캐너에 장착 하 고 PLD 출구 창 앞에 광 디퓨저 (OD)를 장착 하 여 그림 1a에 표시 된 것 처럼 출력 빔을 균질 하 게 만듭니다. PLD를 레이저 드라이버 장치 (LDU)에 연결 합니다.
   참고: PLD는 ~ 816 nm 파장 펄스, 지속 시간에서 ~ 107 ns 펄스 및 최대 2khz 반복 속도와 ~ 3.4 mJ의 최대 펄스 에너지를 생성 합니다. LDU는 냉각기, 12v 전원 공급 장치, 다양 한 고전압 전원 장치로 구성 되어 레이저 전력을 제어 하 고 함수 발생기는 펄스 반복 속도를 변경 합니다.
2. 그림 1b와 같이 각 sutrs 홀더에 8 개의 sutrs를 모두 하나씩 장착 하 여 각 어쿠스틱 리플렉터 표면이 스캔 영역의 중앙을 향하도록 합니다. 케이블 연결을 통해 각 SUTR 케이블을 저 잡음 신호 증폭기에 연결 하십시오.
   참고: 초음파 트랜스듀서의 중앙 주파수는 5Mhz이 고 지름 13mm의 활성 영역이 있습니다. 각각의 24db 게인 2 개 증폭기는 각 채널에 대해 직렬로 연결 됩니다.
3. 냉각기의 전원 공급 장치를 켠 다음 냉각기 스위치를 켜서 20°c와 25°c 사이의 온도를 설정 합니다.
4. 저전압 전원 공급 장치의 전원을 켜고 전류 제어를 천천히 돌려 0.3에서 전류 한계를 설정 합니다. 전압을 12v로 설정 합니다. 전류가 0.1을 초과 하지 않는지 확인 하십시오.
5. 고전압 전원 공급 장치의 전원을 켭니다. "프리셋" 버튼을 누르고 전류를 1 A와 전압을 0v로 설정 합니다. "출력" 버튼: 0v/0A를 활성화 합니다.
6. 기능 발생기의 전원 공급 장치를 켭니다. "리콜" 버튼을 누르고 2 KHz 구성을 선택 하 여이 반복 속도로 레이저 펄스를 생성 하십시오.
7. 그림 1a 에 나타난 바와 같이 아크릴 탱크를 스캐너 내부에 놓고, sutrs의 검출 표면이 물 내부에 완전히 침 지 되도록 탱크를 물에 채웁니다.
8. 모든 SUTRs 감지 표면이 물 매체 내부에 있는지 확인 하십시오. 저 잡음 신호 증폭기의 전원 공급 장치를 켭니다.

2. 쥐 뇌 이미징에 대 한 동물 준비

참고: 건강 한 암컷 쥐 ( 재료 표참조)는 작은 동물 대뇌 피 질 혈관 구조를 이미징 하기 위한 위에서 설명한 데스크탑 pld-PAT 시스템을 시연 하기 위해 사용 되었습니다.

1. 머리와 몸의 움직임을 체포 하 여 뒤쪽에 동물을 잡아. 복 강 내의 혼합물을 100 케 타 민의 2 ml, 자일 라 진 20mg/ml로 2 ml의 식 염 액 (0.2 ml/100g의 투여 량)으로 동물을 마 취 시켰다.
   참고: 주사 후, 동물의 발가락은 다리 또는 신체의 움직임, 발성, 또는 respirations의 표시 된 증가와 같은 어떤 긍정적인 반사에 대 한 테스트 슬쩍. 이러한 반사 작용의 부재는 동물의 성공적인 마 취를 확인 합니다.
2. 마 취 및 레이저 조명으로 인 한 건조를 방지 하기 위해, 매우 신중 하 게 쥐 눈에 인공 눈물 연 고를 적용 합니다. 동물을 작업 대에 엎 어 놓고 머리 트리머를 사용 하 여 동물의 두 피에 털을 제거 하 고 부드럽게 머리 제거 크림을 면도 부분에 바르고 털을 완전히 제거 하십시오.
   1. 4 ~ 5 분 후에 면봉을 사용 하 여 적용 된 크림을 제거 하십시오.
3. 랩 잭의 호흡 마스크 ( 재질 표참조)가 장착 된 맞춤형 동물 홀더 ( 재질 표참조)를 장착 합니다.
4. 홀더의 수평 플랫폼에 머리를 놓을 수 있도록 홀더 위에 동물을 엎 드린 자세로 놓으십시오. 동물을 홀더에 고정 하기 위해 외과 용 테이프를 사용 하십시오.
5. 호흡 마스크가 마 취 혼합물을 전달 하는 쥐의 코와 입을 덮고 있는지 확인 하십시오. 호흡 마스크는 이미징 창에 맞게 사용자 정의 됩니다. 시판 되는 코 콘의 10%가 절단 되어 장갑 조각에 연결 됩니다.
6. 그것을 전환 하기 전에 마 취 기계에 호흡 마스크를 연결 합니다.
7. 마 취 기계를 켜고 동물 호흡 마스크에 0.75% 아이 소 루 레인과 함께 1.0의 산소의 L/min을 포함 하는 마 취 혼합물을 전달 하도록 설정 하십시오.
   1. 그 생리 적 상태를 모니터링 하기 위해 동물의 뒷 다리 중 하나에 맥 박 산소 측정기를 고정.
8. 목화 팁 어플리케이터를 사용 하 여 쥐의 두 피에 무색 초음파 젤의 층을 적용 합니다. 실험실 잭 위치를 스캐너의 중앙으로 조정 하 고 실험실 잭의 높이를 수동으로 조정 하 여 이미징 평면이 음향 반사 기의 중앙에 있도록 합니다.

3. 쥐의 두뇌에 있는 ICG의 통풍 관 및 정리 과정의 생체 내 화상 진 찰

1. 데이터 수집 소프트웨어 ( 재질 표참조)의 매개 변수를 설정 하 여 360 ° 수집 스캔을 합니다.
2. 함수 발생기의 출력을 활성화 하 여 PLD 레이저 방출을 켜십시오 (레이저 방출이 시작 됩니다). 그런 다음, 가변 고전압 전원 공급 장치의 전압을 120 V까지 서서히 증가 시켜 펄스 에너지 당 최대를 제공 합니다.
3. 데이터 수집 소프트웨어 ( 재질 표참조) 프로그램을 실행 하 여 4 초 스캔 시간 동안 8 개의 sutrs를 모두 360 °로 회전 시킵니다.
   주: 예를 들어, sutrs가 4s로 회전 하는 경우 pld는 2000 8000 펄스를 전달 하 고 각 sutrs은 8000 A 라인을 수집 합니다. 이 8000는 20 개 이상의 신호를 평균화 하 여 400로 감소 합니다 (평균화 한 라인 = 8000/20 = 400). 지연 및 합계 다시 프로젝션 알고리즘을 기반으로 하는 재구성 프로그램은 각 SUTR의 스캔 반경을 찾는 데 사용 됩니다.
4. 레이저 방출을 끄려면 함수 발생기의 출력을 비활성화 합니다.
5. 데이터 처리 소프트웨어에서 재구성 알고리즘 사용 ( 재질 표참조) 백 프로젝션 알고리즘을 사용 하 여 시행착오에 의해 모든 8 개의 sutrs의 스캔 반경을 찾으십시오.
6. 0.5 s 스캔 시간 동안 데이터 수집 소프트웨어 ( 재질 표참조)에서 45 ° 수집에 대 한 매개 변수를 설정 합니다.
   주: 예를 들어, SUTRs가 0.5 초 동안 회전 되 면 PLD는 1000 (= 0.5 x 2000) 펄스를 전달 하 고 각 SUTRS은 1000 A 라인을 수집 합니다. 이 1000는 20 개 이상의 신호를 평균화 하 여 400로 감소 합니다 (평균 A-라인 = 1000/20=50).
7. 함수 발생기의 출력을 활성화 하 여 레이저 방출을 켭니다.
8. 데이터 수집 소프트웨어 ( 재료 표참조) 프로그램을 실행 하 여 8 개의 sutrs를 모두 45 °로 회전 시켜 icg를 관리 하기 전에 초기 제어 데이터를 얻습니다.
9. 레이저 방출을 끄려면 함수 발생기의 출력을 비활성화 합니다.
10. 동물의 꼬리 정 맥을 확인 하 고 icg의 0.3 mL (재료 표 참조 323)를 쥐의 꼬리 정 맥에 주입 하십시오.

4.

참고: 1.25 mg의 ICG 분말은 마이크로 계량 기계를 사용 하 여 무게를 측정 하였으며 5 mL의 증류수와 혼합 하 여 ICG 용액에 대해 323 μ m의 농도를 얻었다.

1. 함수 발생기의 출력을 활성화 하 여 레이저 방출을 켭니다.
2. 데이터 수집 소프트웨어 ( 재료 표참조) 프로그램을 실행 하 여 45 ° 회전에서 0.5 s 스캔 시간을 초과 하는 라인을 획득 합니다.

5.

참고: 0.5 s 스캔 시간 동안 얻은 A 라인은 하나의 횡단면 이미지를 생성 하는 데 사용 됩니다. 각 스캔 사이에는 시간 간격이 0.4 ~ 0.6 초입니다.

1. 데이터 수집이 끝난 후 데이터 처리 소프트웨어에서 백 프로젝션 알고리즘을 사용 하 여 ( 재질 표참조) 저장 된 A 라인에서 횡단면 브레인 이미지를 재구성 합니다.
2. 레이저를 끄고 마 취 기계를 끄고 실험실 잭을 낮추고 무대에서 동물을 제거 하십시오. 동물이의 식을 회복 할 때까지 케이지 및 모니터에 동물을 반환 합니다.

그림 1: 데스크탑 PLD-PAT 시스템의 회로도 (A) 데스크탑 pld-PAT의 설계도를 설정 합니다. PLD: 펄스 레이저 다이오드 OD: 광 확산 기, SUTR: 음향 반사판 기반 단일 요소 초음파 트랜스듀서 AM: 마 취 기계 CSP: 원형 스캐닝 플레이트, SM: 스테퍼 모터, LDU: 증폭기, DAQ: 데이터 수집 카드. (B) 스캐닝 센터 주위에 8 개의 sutrs의 원형 배열. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

동적 생체 내 뇌 이미징에 대 한 설명 된 데스크탑 PLD-PAT 시스템의 잠재력은 해당 결과와 함께이 프로토콜에서 전시 되었다. 데스크톱 PLD-PAT 시스템의 고속 이미징 기능은 건강 한 암컷 쥐의 생체 내 뇌 영상을 수행 함으로써 입증 되었다. PA 신호는 4 초 및 0.5 s의 스캔 속도에서 쥐 뇌 주위에 360 ° 및 45 °로 회전 하는 8 개의 SUTRs를 사용 하 여 수집 되었습니다. 도 2a, B 는 각각 4 s 및 0.5의 스캔 속도로 암컷 랫 트 (98 g)의 뇌 이미지를 보여준다. 시상 부 비 동 (SS)과 횡 부 비 동 (TS)은 두 이미지 모두에서 명확 하 게 보입니다. 도 2c , D 는 뇌 영역을 통해 각각 두 피를 제거 하기 전과 후 쥐의 뇌의 사진을 표시 합니다. PAT 화상 진 찰은 온전한 피부와 두개골로 비 침 습 적 이루어졌다.

그림 2: 비 침 습 적 생체 내 데스크탑 PLD-PAT 이미지. (A) 0.5의 스캔 시간에 대뇌 피 질의 맥 관 구조의 생체 내 이미지: 시상 부 비 강, TS: 횡 동비동. (C) 및 (D) 각각 두 피를 제거 하기 전과 후의 쥐 뇌의 사진 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

동일한 쥐의 꼬리 정 맥에 ICG를 주입 하기 전에 제어 데이터를 획득 했습니다. ICG를 주입 한 후, PA 데이터는 0.5 스캔 시간으로 처음 5 분 동안 지속적으로 획득 되었습니다. 그 다음, PA 데이터는 다음 15-20 분 동안 각각 0.5의 스캔 시간으로 ~ 2-3 분 간격으로 획득 되었다. 도 3 은이 하 816 nm에서의 icg에의 한 광학 흡수 증가에의 한 시상 부 비 동 (SS)에서의 평균 PA 신호의 증가를 나타내는 플롯을 나타낸 것 이다 파장은 시간이 지남에 따라 감소 합니다.

그림 3: ICG의 약 동학 ICG의 약 동학은 통풍 관 및 통관 과정을 보여줍니다. 빨간색 화살표 표시는 꼬리 정 맥에 ICG를 주입 하는 시간을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자는 공개에 대 한 관련 금융 이익 또는 잠재적 인 이해 상충이 없습니다.