스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 다양한 세포 구획을 포함하는 복잡한 과정입니다. 여기에서, 우리는 세포 안쪽에 그들의 수송을 감시하기 위하여 형광으로 표지된 snRNAs의 마이크로 주입을 이용했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
스플리케오소말 snRNA의 생물 발생은 핵 및 세포질 상과 마지막 단계가 카잘 바디에게 불린 핵 구획에서 생기는 둘 다 관련시키는 복잡한 프로세스입니다. 그러나, 이 비핵화 구조로 snRNA 국소화를 지시하는 서열은 최근까지 알려지지 않았다. Cajal 바디에 있는 snRNAs의 축적을 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여는, 우리는 형광으로 표지된 snRNAs의 미세 주입을 세포 안쪽에 그들의 현지화에 선행했습니다. 첫째, 우리는 snRNA 결실 돌연변이를 준비, 생체 외 전사에 대한 DNA 템플릿을 합성하고 Alexa488와 결합 된 UTP의 존재에 snRNAs를 전사. 표지된 스노르나스를 TRITC와 결합한 70 kDa-Dextran과 혼합하고, 인간 HeLa 세포의 핵 또는 세포질에 미세주입하였다. 세포는 1시간 동안 배양하고 고정하고 카잘 체 마커 코일린을 간접 면역형광에 의해 가시화하였고, 핵 또는 세포질 주입의 마커 역할을 하는 snRNA 및 dextran은 형광 현미경을 사용하여 직접 관찰되었다. 이 방법은 다양한 서열이 세포 내부의 RNA 국소화에 미치는 영향을 효율적이고 신속하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 Cajal 바디로 snRNA의 능률적인 현지화를 위한 Sm 결합 순서의 중요성을 보여줍니다.
서론
RNA 접합은 스플리세오좀이라고 불리는 큰 리보뉴클레오단백질 복합체에 의해 촉매되는 유전자 발현의 중요한 단계 중 하나입니다. 총 150개 이상의 단백질과 5개의 작은 핵 RNA(snRNAs)가 접합 경로의 다른 단계에서 스플리세오좀에 통합됩니다. U1, U2, U4, U5 및 U6 snRNAs는 주요 GU-AG 인트론의 접합에 참여하고 있습니다. 이러한 snRNAs는 snRNA, snRNA(또는 U6 snRNA와 연관된 유사 Sm 단백질)와 연관된 7개의 Sm 단백질을 포함하는 미리 형성된 작은 핵 리보핵단백질 입자(snRNPs)와 각 snRNP에 특이적인 1-12개의 단백질로 스플리세오좀을 결합한다.
snRNPs의 집합은 세포질과 핵 단계를 관련시킵니다. 새로 전사된 snRNA는 세포질로 수출되어 7개의 Sm 단백질로부터 조립된 고리를 획득합니다. Sm 링은 이후에 핵으로 다시 수입되는 snRNA에 대한 신호로서 작용한다. Sm 단백질과 연관시키지 못하는 결함이 있는 snRNAs는 세포질1에서 유지됩니다. 새로 수입된 snRNPs는 먼저 snRNP 특이적 단백질을 만나고 그들의 성숙을 완료하는 Cajal바디에서 나타납니다 (참조 2,<....
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프로토콜
1. 미세 주입을위한 snRNAs의 준비
- 다음 PCR 설정을 사용하여 PCR에 의한 snRNA의 전체 길이 또는 잘린/돌연변이 버전을 포함하는 DNA 템플릿을 준비합니다: 60s의 경우 98°C, 15초의 경우 98°C, 30초동안 68°C, 1분동안 72°C, 15초용 98°C35x , 5 분 동안 72 °C.
- 순방향 프라이머는 제1 전사 뉴클레오티드의 상류에 대한 시험관내 전사에 대한 프로모터 서열을 포함해야 한다. T7 프로모터 및 역프라이머를 함유하는 순방향 프라이머를 사용하여 U2 snRNA 서열을 증폭시키고, 이는 마지막 전사된 뉴클레오티드로 끝난다(자세한 내용은 재료표 참조).
- T7 RNA 폴리머라제 함유 짧은 RNA 합성을 위한 키트를 사용하여 snRNA를 합성합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM 트리메틸과노신 캡 아날로그(m32,2,7G(5')ppp(5')G), RNA 억제제의 1 mL 및 500-700 ng의 DNA 템플릿을 혼합물및 인큐베큐라에 밤새 혼합하여 300-700 ng의 반응및 인큐베이트에.
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결과
snRNA 국소화 및 Cajal 바디 표적화에서 Sm 결합 부위의 역할을 모니터링하기 위해, 우리는 Sm 결합 부위를 형성하는 7개의 뉴클레오티드(AUUUUUG)가 결여된 T7 프로모터 및 전신 U2 snRNA 또는 U2 snRNA를 포함하는 DNA 템플릿을 준비하였다. snRNAs는 시험관 내 전사, 고립 및 TRITC 결합 된 덱스트란-70kDa와 혼합되었다. 우리는 체외에서 전사된 snRNA를 HeLa 세포의 핵 또는 세포질로 포함하는 혼합물을 미세주입했습니다.
그것은 이전에 Sm 바인딩 사이트가 핵 수입6에필요한 것으로 나타났습니다. Sm 부위가 Cajal 바디 축적을 위해 또한 중요한지 시험하기 위하여는, 우리는 핵으로 Sm 사이트를 결여된 snRNA를 마이크로주입했습니다 (그림1A). 세포질 내로의 주사는 대조군으로 작용하였다(도1B). 양성 .......
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토론
우리는 핵 카잘 바디로 snRNA 현지화를 위해 중요한 순서를 결정하기 위하여 형광표지된 snRNAs의 미세 주입을 이용했습니다. 라벨이 붙은 RNA의 신속하고 다소 간단한 제제로 인해 (PCR에 의한 DNA 템플릿의 준비와 시험관 내 전사) 이 방법은 다양한 서열이 RNA 국소화에 어떻게 기여하는지에 대한 효과적인 분석을 제공합니다. 비교적 짧은 시간에, 우리는 U2 snRNA의 10개의 상이한 삭제 또는 치환을 분석할 수 있었다(참조5 및 데이터가 나타내지 않음). 복잡한 생물 발생 경로를 가진 RNA를 위해, 이 접근은 또한 성숙을 위해 필수적인 시험 순서를 허용합니다. snRNA의 경우, SM 링 어셈블리에 필요한 SM 결합 서열의 결실은 세포질7에서돌연변이된 snRNAs의 격리 및 분해를 초래한다. 다른 유리한 것은 2개의 상이하게 표지된 RNA가 동시에 주입될 수 있고 그들의 현지화가 1개의 세포 내의 직접 비교될 수 있다는 것을 포.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 체코 과학 재단 (18-10035S), 국가 지속 가능성 프로그램 I (LO1419), 기관 지원 (RVO68378050), 유럽 지역 개발 기금 (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775)에 의해 지원되었습니다. 찰스 대학 (GAUK 134516). 우리는 또한 빛 현미경 코어 시설, IMG CAS, 프라하, 체코 (보조금에 의해 지원됩니다 (체코 - 바이오 이미징 - LM2015062)를 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | 재고 농도 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium - 고포도당 | Sigma-Aldrich | D5796 | 함유 4.5 g⁄ L D-glucose, Phenol red 및 항생제 |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µ m 내부 및 0.7 µ m 외경 |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | 재고 농도 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | 그리드가 있는 Coverslips, 직접적인 경험 없음 |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | 재고 농도 40 mM |
| MEGAshortscript T7 전사 키트 | ThermoFisher | AM1354 | |
| 현미경 커버 안경 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | 일상 작업용 |
| 현미경 커버 안경 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | 높음 해상도 이미지 |
| 현미경 DeltaVision | GE 헬스케어 | 이미지 획득 현미경 | |
| DMI6000 | Leica | 미세 주입 | |
| 파라포름알데히드 32% 용액 EM 등급 | EMS | 15714 | 최종 농도 4%까지 파이프에 용해 |
| 페놀:클로로포름 5:1 | 시그마-알드리치 | P1944 | |
| U2 증폭 용 프라이머 : 앞으로: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, 반전: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT | Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence(이탤릭체) | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | 재고 농도 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate 덱스트란 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | 물에 용해, 재고 농도 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | 물에 용해, 스톡 농도 10% |
참고문헌
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.
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재인쇄 및 허가
