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방법 논문

연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

5.6K 조회수

DOI:

10.3791/59804

2019년 9월 14일

이 논문에서

요약

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

초록

유전자의 기능의 해명이 전형적으로 관심의 유전자가 중단된 야생 형 긴장 및 긴장의 표현형 형질의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 다음 기능의 손실은 이후에 중단된 유전자의 산물의 외인성 첨가에 의해 회복된다. 이것은 유전자의 기능을 결정하는 것을 돕습니다. 앞서 설명한 방법은 gtfC 유전자-중단된 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것을 포함한다. 여기서, 유전자 파괴 에 이어 새로 생성된 S. 뮤탄스 균주로부터 gtfC 유전자 생성물을 정제하기 위한 까다로운 방법이 기술된다. 그것은 관심있는 유전자의 3′끝에서 폴리히스티딘 코딩 서열을 첨가하는 것을 포함하며, 이는 고정 된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유전자 생성물의 간단한 정제를 허용합니다. 이 방법의 유전자 변형에는 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않습니다. 유전자 중단 후 외인성 첨가에 의한 유전자 생성물의 복원은 유전자 기능을 결정하는 효율적인 방법이며, 이는 또한 다른 종에 적용될 수 있다.

서론

유전자의 기능의 분석은 일반적으로 관심있는 유전자가 중단된 균주에 야생 형 긴장의 표현형 특성의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 균주가 생성되면, 유전자 제품의 외인성 추가는 기능적 복원을 허용한다.

후속 복원 검사에 필요한 정제된 유전자 제품을 얻는 가장 일반적인 방법은 대장균1에서이종 발현을 수행하는 것이다. 그러나, 막 단백질 또는 고분자 질량 단백질의 발현은 종종 이 시스템을 사용하여 어렵다1. 이러한 경우에, 표적 단백질은 일반적으로 유전자 생성물의 손실로 이끌어 낼 수 있는 단계의 복잡한 시리즈를 통해 단백질을 기본적으로 종합하는 세포에서 단리됩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 파괴 방법2,PCR 기반 DNA 접합 방법3(지정 2단계 융합 PCR) 및 유전적 용 전기 천공에 따른 유전자 생성물 정제를 위한 간단한 절차가 개발되었습니다. 연쇄상 구균 뮤탄의변환 . 유전자 생성물의 C-말단에 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 첨가하면 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 그 정제가 용이합니다.

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프로토콜

참고: gtfC 유전자의 전체 코딩 영역이 spcr로 대체되는 S. 뮤탄스 □gtfC의 생성은 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 완료되어야 한다. 5세대에대한 자세한 내용은 게시된 문서를 참조하십시오.

1. 프라이머 디자인

  1. S. 뮤탄스 그의gtfC의건설을위한 프라이머를 준비합니다.
    참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머 시퀀스는 표 1에나와 있습니다. S. 뮤탄스-gtfC의 생성을 위한 2단계 융합 PCR 방법은 도 2에도시된 것이다.
    1. 설계 프라이머(gtfC-reversespcr-forward)그의 태그 코딩 서열의 부착에 대 한, gtfC 유전자와 spcr 사이 개입(그림 2A).

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결과

도 3은 제1 PCR(도3A)및 제2 PCR(도3B)으로부터의각 앰플리컨의 크기를 나타낸다. 각 앰플리곤의 크기는 표 1에설명된 바와 같이 예측된 크기와 일치합니다. 도 4A는 S. 뮤탄스 콜로니가 두 번째 PCR 제품으로 변형되고 스펙토마이신을 함유하는 BHI 한천 플레이트상에 도금된 것을 나타낸다. 콜로니 PCR 제품은 아가로즈겔(도 4B)에서실행하였다. 각 앰플리톤은 표 1에기재된 바와 같이 예측된 크기였다. 그림 5는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 이미지를 보여줍니다........

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토론

프라이머의 설계는 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. gtfC-reverse 및 spcr-forward프라이머의 시퀀스는 gtfC의 3′ 끝 영역과 spcr의5′ 끝 영역의 시퀀스에 따라 자동으로 결정되었습니다. 각 프라이머에는 GS 링커와 5' 영역에서 His-tag 코딩 시퀀스를 인코딩하는 24개의 보완 베이스가 포함되어 있습니다. 상류 측면 영역에 위치한 네이티브 조절 시퀀스의 중단은 3′ 끝에 His-tag 코딩 시퀀스를 추가하여 피할 수 있다. DNA 스톱 코돈은 gtfC-리버스프라이머로부터 제거하고 spcr-forward프라이머에 첨가해야 한다. 더욱이, gtfC-forwardspcr-reverse는 S. 뮤탄스 WT 게놈에서 상동 재조합의 대상 영역의 약 1kb 상류 및 하류의 측면 영역을 .......

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 일본과학진흥회(JSPS)(교부금 번호 16K15860 및 19K10471~T.M., 17K12032~M.I., 18K0926~N.H.) 및 SECOM 과학기술재단(SECOM)(보조금 번호 2010.10.19.19.1.1.19)에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AgaroseNippon GeneticsNE-AG02아가로스 젤 전기영동용
Anaeropack MitsubishiGas ChemicalA-03혐기성 배양 시스템
Anti-His-Tag 단클론 항체MBLD291-7HRP-conjugated
BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23227단백질 농도 측정
뇌 심장 주입 국물Becton, Dickinson237500박테리아 배양 배지
CBB R-250Wako031-17922생물막 염색용
원심 한외 여과 장치SartoriusVS2032버퍼 교체 및 단백질 농도
원심분리기Kubota7780II
크로마토그래피 컬럼Bio-Rad7321010IMAC
투석 멤브레인 클램프Fisher 브랜드21-153-100
투석 튜빙As One2-316-06
DNA 중합효소TakaraR045A고충실도 DNA 중합효소
DNA 염기서열분석Eurofins Genomics
ECL 기질Bio-Rad170-5060웨스턴 블로팅용
EDTA (0.5 M pH 8.0)Wako311-90075Tris-EDTA 완충액
준비 전기천공법 큐벳Bio-Rad16520860.2 cm 갭
ElectroporatorBio-Rad1652100
EtBr 용액Nippon Gene315-90051아가로 젤 전기 영동
젤 밴드 커터Nippon GeneticsFG-830
젤 추출 키트Nippon GeneticsFG-91202아가로스 젤에서 DNA 추출
이미저GE 헬스케어29083461SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅용
Wako095-00015결합 완충액 및 용출 완충액 준비
인큐베이터Nippon Medical & 화학 기기EZ-022온도 설정: 4 > C
인큐베이터Nippon Medical & 화학 기기LH-100-RDS온도 설정: 37 > C
멤브레인 필터Merck MilliporeJGWP047000.2 µ m 직경
미세 원심 분리기Kubota3740
NaClWako191-01665결합 완충액 및 용출 완충액
NaH2PO4·의 준비; 2H2OWako192-02815결합 완충액 및 용출 완충액의 제조
NaOHWako198-13765결합 완충액 및 용출 완충액
(NH4)의 제조 2SO4Wako015-06737황산암모늄 석출
Ni-charged 수지Bio-Rad1560133IMAC의 경우
PCR 프라이머Eurofins Genomics맞춤형
주문 단백질 표준Bio-Rad161-0381SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅
용제 여과 장치1FH-1G
스펙티노마이신Wako195-11531항생제;100 &mu에서 사용; g/mL
멸균 주사기 필터MerckmilliporeSLGV004SL0.22 µ m 직경
Streptococus mutans Δ 실험실의 gtfCStock 변형률.gtfC spcr
> Streptococus mutans UA159의 주식 균주.S. mutans ATCC 700610, 야생형 균주
설탕Wako196-00015생물막 개발용
TAE (50 × )Nippon Gene313-90035아가 로즈 젤 전기 영동
열 순환기Bio-RadPTC-200
Tris-HCl (1M, pH 8.0)Wako314-90065Tris-EDTA 완충 준비
로 대체실험실

참고문헌

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional an....

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재인쇄 및 허가

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