연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

요약

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

초록

유전자의 기능의 해명이 전형적으로 관심의 유전자가 중단된 야생 형 긴장 및 긴장의 표현형 형질의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 다음 기능의 손실은 이후에 중단된 유전자의 산물의 외인성 첨가에 의해 회복된다. 이것은 유전자의 기능을 결정하는 것을 돕습니다. 앞서 설명한 방법은 gtfC 유전자-중단된 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것을 포함한다. 여기서, 유전자 파괴 에 이어 새로 생성된 S. 뮤탄스 균주로부터 gtfC 유전자 생성물을 정제하기 위한 까다로운 방법이 기술된다. 그것은 관심있는 유전자의 3′끝에서 폴리히스티딘 코딩 서열을 첨가하는 것을 포함하며, 이는 고정 된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유전자 생성물의 간단한 정제를 허용합니다. 이 방법의 유전자 변형에는 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않습니다. 유전자 중단 후 외인성 첨가에 의한 유전자 생성물의 복원은 유전자 기능을 결정하는 효율적인 방법이며, 이는 또한 다른 종에 적용될 수 있다.

서론

유전자의 기능의 분석은 일반적으로 관심있는 유전자가 중단된 균주에 야생 형 긴장의 표현형 특성의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 균주가 생성되면, 유전자 제품의 외인성 추가는 기능적 복원을 허용한다.

후속 복원 검사에 필요한 정제된 유전자 제품을 얻는 가장 일반적인 방법은 대장균^1에서이종 발현을 수행하는 것이다. 그러나, 막 단백질 또는 고분자 질량 단백질의 발현은 종종 이 시스템을 사용하여 어렵다^1. 이러한 경우에, 표적 단백질은 일반적으로 유전자 생성물의 손실로 이끌어 낼 수 있는 단계의 복잡한 시리즈를 통해 단백질을 기본적으로 종합하는 세포에서 단리됩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 파괴 방법^2,PCR 기반 DNA 접합 방법^3(지정 2단계 융합 PCR) 및 유전적 용 전기 천공에 따른 유전자 생성물 정제를 위한 간단한 절차가 개발되었습니다. 연쇄상 구균 뮤탄의변환 . 유전자 생성물의 C-말단에 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 첨가하면 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 그 정제가 용이합니다.

프로토콜

참고: gtfC 유전자의 전체 코딩 영역이 spc^r로 대체되는 S. 뮤탄스 □gtfC의 생성은 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 완료되어야 한다. ^5세대에대한 자세한 내용은 게시된 문서를 참조하십시오.

1. 프라이머 디자인

1. S. 뮤탄스 그의gtfC의건설을위한 프라이머를 준비합니다.
   참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머 시퀀스는 표 1에나와 있습니다. S. 뮤탄스-gtfC의 생성을 위한 2단계 융합 PCR 방법은 도 2에도시된 것이다.
   1. 설계 프라이머(gtfC-reverse및 spc^r-forward)그의 태그 코딩 서열의 부착에 대 한, gtfC 유전자와 spc^r 사이 개입(그림 2A).

결과

도 3은 제1 PCR(도3A)및 제2 PCR(도3B)으로부터의각 앰플리컨의 크기를 나타낸다. 각 앰플리곤의 크기는 표 1에설명된 바와 같이 예측된 크기와 일치합니다. 도 4A는 S. 뮤탄스 콜로니가 두 번째 PCR 제품으로 변형되고 스펙토마이신을 함유하는 BHI 한천 플레이트상에 도금된 것을 나타낸다. 콜로니 PCR 제품은 아가로즈겔(도 4B)에서실행하였다. 각 앰플리톤은 표 1에기재된 바와 같이 예측된 크기였다. 그림 5는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 이미지를 보여줍니다........

토론

프라이머의 설계는 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. gtfC-reverse 및 spc^r-forward프라이머의 시퀀스는 gtfC의 3′ 끝 영역과 spc^r의5′ 끝 영역의 시퀀스에 따라 자동으로 결정되었습니다. 각 프라이머에는 GS 링커와 5' 영역에서 His-tag 코딩 시퀀스를 인코딩하는 24개의 보완 베이스가 포함되어 있습니다. 상류 측면 영역에 위치한 네이티브 조절 시퀀스의 중단은 3′ 끝에 His-tag 코딩 시퀀스를 추가하여 피할 수 있다. DNA 스톱 코돈은 gtfC-리버스프라이머로부터 제거하고 spc^r-forward프라이머에 첨가해야 한다. 더욱이, gtfC-forward및 spc^r-reverse는 S. 뮤탄스 WT 게놈에서 상동 재조합의 대상 영역의 약 1kb 상류 및 하류의 측면 영역을 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agarose	Nippon Genetics	NE-AG02	아가로스 젤 전기영동용
Anaeropack Mitsubishi	Gas Chemical	A-03	혐기성 배양 시스템
Anti-His-Tag 단클론 항체	MBL	D291-7	HRP-conjugated
BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher Scientific	23227	단백질 농도 측정
뇌 심장 주입 국물	Becton, Dickinson	237500	박테리아 배양 배지
CBB R-250	Wako	031-17922	생물막 염색용
원심 한외 여과 장치	Sartorius	VS2032	버퍼 교체 및 단백질 농도
원심분리기	Kubota	7780II
크로마토그래피 컬럼	Bio-Rad	7321010	IMAC
투석 멤브레인 클램프	Fisher 브랜드	21-153-100
투석 튜빙	As One	2-316-06
DNA 중합효소	Takara	R045A	고충실도 DNA 중합효소
DNA 염기서열분석	Eurofins Genomics
ECL 기질	Bio-Rad	170-5060	웨스턴 블로팅용
EDTA (0.5 M pH 8.0)	Wako	311-90075	Tris-EDTA 완충액
준비 전기천공법 큐벳	Bio-Rad	1652086	0.2 cm 갭
Electroporator	Bio-Rad	1652100
EtBr 용액	Nippon Gene	315-90051	아가로 젤 전기 영동
젤 밴드 커터	Nippon Genetics	FG-830
젤 추출 키트	Nippon Genetics	FG-91202	아가로스 젤에서 DNA 추출
이미저	GE 헬스케어	29083461	SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅용
	Wako	095-00015	결합 완충액 및 용출 완충액 준비
인큐베이터	Nippon Medical & 화학 기기	EZ-022	온도 설정: 4 > C
인큐베이터	Nippon Medical & 화학 기기	LH-100-RDS	온도 설정: 37 > C
멤브레인 필터	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µ m 직경
미세 원심 분리기	Kubota	3740
NaCl	Wako	191-01665	결합 완충액 및 용출 완충액
NaH2PO4·의 준비; 2H2O	Wako	192-02815	결합 완충액 및 용출 완충액의 제조
NaOH	Wako	198-13765	결합 완충액 및 용출 완충액
(NH4)의 제조 2SO4	Wako	015-06737	황산암모늄 석출
Ni-charged 수지	Bio-Rad	1560133	IMAC의 경우
PCR 프라이머	Eurofins Genomics	맞춤형
주문 단백질 표준	Bio-Rad	161-0381	SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅
용제 여과 장치	1	FH-1G
스펙티노마이신	Wako	195-11531	항생제;100 &mu에서 사용; g/mL
멸균 주사기 필터	Merckmillipore	SLGV004SL	0.22 µ m 직경
Streptococus mutans Δ 실험실의 gtfC	Stock 변형률.		gtfC spcr
> Streptococus mutans UA159	의 주식 균주.		S. mutans ATCC 700610, 야생형 균주
설탕	Wako	196-00015	생물막 개발용
TAE (50 × )	Nippon Gene	313-90035	아가 로즈 젤 전기 영동
열 순환기	Bio-Rad	PTC-200
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	Wako	314-90065	Tris-EDTA 완충 준비

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