분화된 HepaRG 세포에서 베아토시스 유도 및 특성화

요약

본 연구에서는, 지방산 염 나트륨 올레아테를 사용하여 분화된 HepaRG 세포에서 간 용술증을 유도하기 위한 상세한 프로토콜을 설명하고, 일관된 항스톡스를 포함한 지질 축적의 검출 및 정량화를 위한 방법을 채택한다. 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법, 세포 형광 분석, 오일 레드 O 염색, 및 qPCR.

초록

간 지방 세포는 간세포에 트리글리세라이드 함유 지질 방울의 축적에서 발생하는 대사 기능 장애를 나타냅니다. 과도한 지방 축적은 잠재적으로 가역적이고 비 알코올 성 지방 간염 (NASH) 및 결국 간경변 및 간세포 암종 (HCC)으로 진화 할 수있는 비 알코올 성 지방 간 질환 (NAFLD)으로 이어집니다. NASH에 진행과 간세포에서 지질 축적을 연결 하는 분자 메커니즘, 돌이킬 수 없는 간 손상, 섬유 증, 간 경 변, 그리고 심지어 HCC 는 여전히 불분명 남아. 이를 위해, 몇몇 생체외 및 생체내 모형은 NAFLD를 일으키는 원인이 되는 병리학 적인 프로세스를 해명하기 위하여 개발되었습니다. 본 연구에서, 우리는 지방산 염 나트륨 올레아테로 처리된 DMSO 분화 인간 간 HepaRG 세포로 구성된 간 소포증의 유도를 위한 세포 모델을 기술한다. 실제로, 나트륨 올레아테 처리 된 HepaRG 세포는 세포질에 지질 방울을 축적하고 스테토시스의 전형적인 특징을 보여줍니다. 이러한 시험관내 인간 모델은 생체내 마우스 모델뿐만 아니라 1차 인간 간세포에 대한 귀중한 대안을 나타낸다. 우리는 또한 오일 레드 O 염색, 세포 불변 보디피 측정, qPCR에 의한 대사 유전자 발현 분석 및 일관된 항 스토크스를 포함한 HepaRG 세포의 지방 축적의 정량화 및 평가를 위한 여러 가지 방법의 비교를 제시합니다. 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법. CARS 이미징은 재료 과학 응용 분야에서 잘 알려진 화학 분석 기술인 라만 분광법의 화학적 특이성과 정밀한 정밀성을 허용하는 고속, 고해상도 비선형 광학 현미경의 이점을 결합합니다. 지질 축적 및 지질 방울 역학의 정량화. 혈관 성 증의 유도를위한 효율적인 시험관 내 모델의 설립, 지질 축적의 정량화 및 특성화에 대한 정확한 방법과 함께, 통해 NAFLD의 조기 진단의 개발로 이어질 수 분자 마커의 식별, 새로운 치료 전략의 생성에.

서론

간 지방 증은 간 지방 축적으로 정의 됩니다., 트리 글리세라이드 를 포함 하는 지질 방울 내에서, 적어도의 5% 간 무게의. 장기간 된 간 지질 저장은 잠재적으로 가역적인 과정, 그러나, 그것은 간 대사 기능 장애로 이어질 수 있습니다., 염증 및 비 알코올 지방 간 질환의 고급 형태 (NAFLD), 많은 부분에서 만성 간 질환의 주요 원인 세계^1,2. NAFLD는 더 공격적인 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진화할 수 있는 다인성 질환으로, 이는 차례로 간경변으로 진행될 수 있고, 환자의 작은 비율로, 간세포암종(HCC)1,^3. 아니 승인 된 치료는 NAFLD에 대한 특정 치료로 현재 사용할 수 있으며 식이 요법과 라이프스타일 수정의 조합은 NAFLD 및 NASH 관리의 기둥 남아 4,^5,6.

NAFLD의 병인에서 간 지방증의 발달로 이어지는 분자 메커니즘은 여전히 해명 될 남아7. 이러한 맥락에서, 마우스 모델은 인간 steatosis 질병 진행을 연구하기 위해 개발되었다. 다른 모형의 무수한 존재하고, 각각은 다른 접근을 결합하는 유전, 영양 및 화학적으로 유도한 모형을 포함하여 그것의 장단점이 있습니다. 유전자 변형 (형질 전환 또는 녹아웃) 마우스는 자발적으로 간 질환을 개발합니다. 그러나, 이러한 돌연변이는 인간에서 매우 드물며 단일 유전자(예를 들어, ob/ob 마우스)의 삭제 또는 과발현은 분자 수준^8,9에서다인성 인간 질환의 병인을 모방하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 한다. 마찬가지로, 식이 요법 이나 약리학 조작 후 쥐에 의해 취득 된 질병은 남자 8에서NAFLD의 발달과 관련된 인간의 식단의 효과를 모방하지 않을 수 있습니다. 동물 모형은, 그러나, NAFLD의 이해에 있는 발달을 촉진하고 이 접근은 현재 실험실 연구에서 가장 빈번히 이용되는 전략입니다. 그럼에도 불구하고, 동물 모델에서 얻은 결과의 인간에서의 복제는 반복적으로 실패하여, 클리닉(10)으로의 번역이 불량하게 되었다.

따라서, NAFLD의 시험관내 모델은 NAFLD 진행의 분자 메커니즘을 해명시키는 데 근본적인 역할을 할 수 있으며, 이들은 많은 수의 화합물을 스크리크하는 귀중한 도구를 나타낸다. 1 차적인 세포 배양, 불멸의 세포주 및 간 생검은 연구 목적을 위해 광범위하게 이용되었습니다^11. 1 차적인 인간 간세포는 밀접하게 인간 임상 조건과 유사합니다, 그러나 기증자의 한정된 수가 있고, 1 차적인 세포 배양은 세포의 가변성 때문에 나쁜 재현성을 보여줍니다. 이러한 관찰, 윤리적 및 물류 문제와 함께, 인간의 기본 간세포의 사용은 제한되는 결과¹². 따라서, 간 세포주들은 간 세포주들이 꾸준히 성장함에 따라 1차 배양에 비해 몇 가지 필수적인 장점을 가지며, 거의 무제한의 수명을 가지며, 안정적인 표현형을 가지는 편리한 대안을 나타낸다. 더욱이, 세포주 쉽게 접근할 수 있고 간 세포주 배양 조건은 1 차적인 간세포의 그것 보다는 더 간단하고 다른 실험실 중 표준화됩니다.

여기서, 우리는 지방산 나트륨 올레아테로 처리된 간 분화 HepaRG 세포로 대표되는 간 베아실 지방증의 체외 세포 기반 모델을 상세히 기술한다. HepaRG 세포주C형 간염 감염및 에드먼드슨 급I의 잘 분화된 간종양(14)에 의해 영향을 받는 여성 환자로부터 확립되었다. HepaRG 세포주 2% 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 노출시 분화 할 수있는 인간 이중 성 전구 세포주 두 개의 상이한 세포 표현형: 담즙 같은 및 간세포 유사 세포. 분화된 HepaRG 세포(dHepaRG)는 성인 간세포와 몇 가지 특징과 특성을 공유하고 알부민, 알돌라세비, 시토크롬 P450 2E1(CYP2E1) 및 시토크롬 P450 3A4(CYP3A4) 13과 같은 간 특이적 유전자를 안정적으로 발현할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. (3단계)를 참조하십시오. 지방산 염나트륨 올레아테(250 μM)를 5일간 사용하여 dHepaRG 세포를 치료하면 세포질 지질 방울의 생성으로 이어지며, 지방간^14,15,^17,18의 효과를 모방한 것이다. 4단계). 지질 방울의 축적은 오일 레드 O 염색에 의해 쉽게 검출 될 수있다 (단계 5), 중성 트리글리세라이드와 지질 적색 오렌지를 얼룩 리소크롬 지방 수용성 염료. 지방 dHepaRG에서 지질을 효율적으로 정량화하기 위해, 여기에서 우리는 4,4-디플루오로-1,3,5,7-tetramethyl-4-보라-3a,4a-디아자-s-indacene (보디피 505/515)(단계 6), 립성 프로브로 염색 한 후 세포 불용형 분석을 보여줍니다. 세포 내 지질 체및 지질 방울 라벨에 사용 되었습니다¹⁹. 더욱이, 여기서 우리는 dHepaRG 세포에서 여러 대사 유전자의 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) (단계 7) 유전자 발현 완화에 의해 세포증을 평가하는 방법을 보여준다. 올레아테 나트륨 처리 후 지질 방울의 축적을 더욱 특성화하고 정량화하기 위해, 우리는 일관된 안티 스토크스 라만 산란 (CARS) 현미경 검사법 (단계 8)을 수행, 시각화 및 정량화를 가능하게하는 혁신적인 기술 20,^21.

프로토콜

1. 문화매체 및 시약준비

1. 증식 배지: 글루타맥스, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 5 μg/mL 인슐린, 0.5 μM 하이드로코르티손 헤미쿠시네이트를 보충하세요.
2. 분화 매체: 글루타맥스, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토미신, 5 μg/mL 인슐린, 50 μM 하이드로코르티손 헤미쿠시네이트 및 2% DMSO를 보충합니다.
3. 동결 매체: 10% DMSO로 증식 배지를 보충합니다.
4. 올레아테 나트륨: 100 mM 농도에서 99% 메탄올에 용해하고, O/N을 저어서 -20°C에서 보관하십시오.
5. 오일 레드 O : 재고 솔루션을 준비합니다. 오일 레드 O 0.35 g의 무게와 이소프로판올 100 mL에 용해. O/N, 필터(0.2 μm)를 저어서 RT에 보관하십시오. 실온(RT)에 20분 동안 앉은 다음 0.2 μm 필터로 걸입니다. 적절한 여과는 배경을 피하기 위해 성공적인 염색을 위해 적극 권장됩니다.
6. Bodipy (505/515): 100 μM 재고 농도에서 DMSO에 Bodipy (505/515) 염료를 용해하고, 어둠 속에서 -20 °C에 보관하고, 최종 100 nM 농도에서 사용하십시오.
7. CARS 실험을 위해 투명 유리 바닥 접시를 획득하십시오.

2. 해동, 증폭 및 HepaRG 세포의 동결 보존

1. 해동질소를 동결보존된 HepaRG 세포를 해동될 때까지 37°C 의 배스에서 배치를 침지하여. 낮은 통로 배치(<20)를 선택합니다. HepaRG 세포는 시판되고 있다.
2. 세포를 5분 동안 증식 배지 및 원심분리기 10 mL을 함유하는 15 mL 튜브로 빠르게 전달합니다(200 x g, 4°C).
3. 상급체를 버리고 증식 배지의 5 mL로 세포를 다시 일시 중단하십시오.
4. 세포를 계산하고 2.5 x 10^{4 세포} /cm2플레이트하기 위해 희석하십시오.
5. 매 2 또는 3 일마다 매체를 갱신하십시오. 세포는 약 24 시간의 두 배로 증식합니다.
6. 트립신 용액0.05%로 3-5분 배양에 의한 80% 수렴시 헤파RG 세포를 분리한다. 5 분 (200 x g, 4 °C)에 대한 증식 배지 및 원심 분리기에서 세포를 수집합니다.
7. 상급체를 버리고 증식 배지의 5 mL로 세포를 다시 일시 중단하십시오.
8. 세포를 계산하고 2.5 x 10^{4 세포} /cm2플레이트하기 위해 희석하십시오.
9. 이 단계에서, 2.5-2.8 단계를 반복하여 세포를 증폭시켜 적절한 수의 세포에 도달하여 실험을 시작하거나 2.10단계에서와 같이 냉동 보존한다.
10. HepaRG 세포를 냉동 보존하기 위해, 트립신 용액 0.05%로 3-5 분 배양하여 도금 한 후 세포를 24 시간 분리하십시오. 5 분 (200 x g, 4 °C)에 대한 증식 배지 및 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. 상한을 버리고, 동결 매체의 1 mL / 배치, 1.5 x 10⁶ 세포 / 배치로 세포를 다시 중단하고 액체 질소로 배치를 냉동 보존하십시오.

3. 헤파RG 세포의 분화 (일 0-21) (그림1A)

1. 일 0. 종자 HepaRG 세포를 저밀도(2.5 x 10⁴ 세포/cm2)로 배양처리된 접시에 적절한 부피가 있는 증식 배지(도1B). 각 분석(오일 레드 O 염색, FACS 분석, qPCR)에 대해 두 가지 접시를 도금해야 합니다: 대조군 세포와 올레에이트 처리 된 세포에 대해 하나. CARS 측정을 수행하는 경우 (8 단계), 투명 유리 바닥 접시에 병렬로 세포를 씨앗. 대조군으로서, 분화 마커 유전자의 유전자 발현 분석을 수행하기 위해 처리되지 않은 접시 1개(증식 세포 0)를 수확한다(단계 3.6 참조).
2. 2일차와 4일차. 적절한 부피의 증식 배지로 배지를 변경하고 세포가 합류 할 때까지 성장하게하십시오.
3. 7일차. 셀은 100% 동조여야 합니다(그림1C). 1x 인산완충식염수린(PBS)으로 세포를 한 번 세척합니다. 1x PBS를 제거하고 적절한 분화 매체 볼륨을 추가합니다.
4. 8일, 9일, 12일, 15일, 18일.  1x PBS로 세포를 한 번 씻으소서. 1x PBS를 제거하고 적절한 분화 매체 볼륨을 추가합니다.
5. 21일째. 현미경으로 HepaRG 세포를 관찰하고 세포가 분화 배양체가 결합되어 있는지 확인합니다(그림1D).
6. 대조군으로서, 1개의 대조군 접시(분화세포일21)를 수확하여 분화 마커 유전자의 유전자 발현 분석(step 7)을 수행한다(도1E).
7. 21일째에, 분화된 HepaRG 세포는 액체 질소에서 냉동 보존될 수 있습니다.

4. 수혈선증 유도 (21-26일차)

1. 21일째. 나트륨 올레아테(100 mM)를 250 μM(1:400)의 최종 농도로 완전한 분화 배지의 적절한 부피로 희석한다. 99% 메탄올 1:400(올레아테 나트륨과 동일한 부피)을 분화 배지의 또 다른 aliquot에 첨가하여 차량 제어 처리를 합니다. (예를 들어: 25 μL의 나트륨 올레아테를 배지 의 10 mL에 추가하고 병렬로 99 % 메탄올의 25 μL을 중간 10 mL에 추가하십시오). 세포를 1x PBS로 한 번 씻고 비히클 또는 나트륨 올레에이트 배지를 추가하십시오.
2. 23일째와 25일째. 4.1단계에서와 같이 갓 준비한 배지의 적절한 부피로 배지를 변경합니다.
3. 26일째. 광학 현미경으로 관찰하는 지질 방울은 나트륨 올레아테 처리 세포에 축적되고 그림 2A에서와 같이 세포질에서 반투명 방울로 쉽게 볼 수 있습니다.

5. 지질 과부하 및 스테토증 유도평가: 오일 레드 O 스테인링

1. 1x PBS로 세포를 한 번 씻고 1x PBS를 완전히 제거하십시오.
2. 4% 파라포름데히드(1x PBS로 희석)를 넣고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
   주의 사항: 파라 포름 알데히드는 독성이 있으므로이 단계는 장갑, 실험실 코트 및 마스크를 포함한 보호 장비가있는 연기 후드에서 수행해야합니다.
3. 파라포름알데히드를 제거하고 1x PBS로 세포를 두 번 씻으하십시오. 세포는 염색하기 전에 며칠 동안 4°C에서 1x PBS로 보관될 수 있다. 파라필름으로 감싸고 알루미늄 호일로 덮어 세포가 건조되는 것을 방지합니다.
4. PBS를 1x 제거합니다. RT에서 5 분 동안 60 % 이소 프로판올로 세포를 배양하십시오.
5. 이소프로판올을 제거하고 RT에서 세포를 완전히 건조시키십시오.
6. 오일 레드 O 작업 용액을 추가하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오. 각 샘플에 필요한 작업 용액의 부피는 셀 배양에 사용되는 미디어의 부피에 해당합니다.
7. 오일 레드 O 용액을 제거하고 즉시 ddH₂O를추가하십시오.
8. 분석을 위해 현미경으로 이미지를수집합니다(그림 2B).
9. 오일 레드 O 염료를 용해하려면 : 모든 물을 제거하고 건조 할 수 있도록; 100% 이소프로판올 1mL를 넣고 RT에서 부드럽게 흔들면서 10분 동안 배양합니다.
10. 용출 오일 레드 O 염료와 이소 프로판올을 여러 번 파이펫, 모든 오일 레드 O가 용액에 있는지 확인. 솔루션을 큐벳으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김. 분광광도법에 의해 OD₅₀₀ nm을 측정하고 100% 이소프로판올을 공백으로 사용합니다(그림2C).

6. 지질 과부하 및 스테토증 유도 평가: 보디피 염색 및 세포불소화분석

1. 1x PBS로 세포를 한 번 씻으소서. 보디피 100 nM을 배양하여 37°C에서 40분 동안 어둠 속에서 1x PBS로 희석하였다. 유세포분석측정에 스테인드되지 않은 제어가 포함되어야 합니다. 이 시점에서 가능한 한 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
   참고: 각 샘플에 필요한 염색 용액의 부피는 세포 배양에 사용되는 매체의 부피에 해당합니다.
2. 염색 용액을 제거하고 1x PBS로 세포를 한 번 씻으하십시오. 6.3-6.6 단계로 진행합니다. FACS (형광 활성화 세포 선별) 분석 또는 현미경 이미징을위한 6.7 단계.
3. 1x PBS로 세포를 부드럽게 긁어 내고 15 mL 튜브로 옮김하십시오. 10 분 동안 원심 분리기 (200 x g, 4 °C).
4. 펠릿을 방해하지 않고 부드럽게 수퍼나이트를 제거하고 1x PBS 의 3 mL로 씻으십시오. 5 분 동안 원심 분리기 (200 x g, 4 °C).
5. 상피제를 제거하고 1x PBS의 300 μL에서 다시 중단한 다음 FACS 튜브로 옮김을 옮김을 제거합니다.
6. 505/515 nm의 여기/방출 파장을 가진 세포 불형 분석으로 보디피 형광 강도를 즉시 측정합니다(그림3A,B).
7. 1x PBS로 세포를 한 번 씻고 PBS를 완전히 제거하십시오.
8. 4% 파라포름데히드(1x PBS로 희석)를 넣고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
   주의 사항: 파라 포름 알데히드는 독성이 있으므로이 단계는 장갑, 실험실 코트 및 마스크를 포함한 보호 장비가있는 연기 후드에서 수행해야합니다.
9. 파라포름알데히드를 제거하고 샘플을 PBS에서 5분 동안 3x 세척합니다. 세포는 4°C에서 1x PBS로 유지되거나 즉시 이미지화될 수 있다(도3C). 보관을 위해 파라필름으로 감싸고 알루미늄 호일로 덮어 세포가 건조되는 것을 방지하십시오.

7. 지질 과부하 및 steatosis 유도의 평가: qPCR

1. 1x PBS로 세포를 한 번 씻으소서. 1 x PBS로 세포를 긁어 내고 200 x g의 원심 분리기를 제거하고 상한체를 버립니다. 이 단계에서, 세포는 -80°C에서 수확되거나 7.2단계에서와 같이 처리될 수 있다.
2. 제조업체의 지침에 따라 상용 시약을 사용하여 표준 방법으로 총 RNA 격리를 수행합니다.
3. UV 분광광도 측정을 통해 RNA 농도를 평가하여 A260/A280 판독값을 기준으로 RNA 순도가 2.0에 가깝도록 합니다.
4. 표준 cDNA 합성 키트로 총 RNA 의 1 μg에서 cDNA를 합성합니다.
5. CDNA를 H 2O로 최종 50 μL 부피에 희석한다.
6. qPCR에 의해 삼중으로 각 cDNA 샘플을 분석: 대조군으로 3개의 하우스키핑 유전자에 특정한 프라이머를 포함하여 각 프라이머에 필요한 반응에 충분한 하나의 qPCR 마스터 믹스(표 1)를 준비합니다: gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), 액틴B 및 리보소말 18S (프라이머 서열에 대한 재료 표 참조):
7. PCR 멀티월 플레이트에서 잘 당 마스터 믹스 18 μL을 분배합니다.
8. 각 우물에 2 μL의 cDNA 샘플을 추가합니다. 접시를 밀봉합니다.
9. 열 주기 명령에 따라 샘플을 실행합니다.

8. 지질 과부하 및 steatosis 유도의 평가: CARS

1. 5.1-5.3 단계에 설명된 대로 유리 바닥 접시에 이전에 준비된 세포를 수정합니다.
2. 상용 튜닝 가능한 피코초 펄스 레이저 시스템을 켜서 튜닝하여 서로 다른 파장의 두 출력을 얻습니다. 출력 사이의 주파수 차이는 메틸렌 대칭 스트레칭에 해당하는 강렬한 CARS 광 신호를 생성하기 위해 2,840 cm -1이어야합니다. 1,064 nm ("스토크스"빛)에서 고정 파장 출력의 경우, 다른 파장은 817 nm ("펌프"빛)로 조정되어야한다.
3. 817 nm 출력이 공간적으로 그리고 시간적으로 1,064 nm 출력과 중첩되도록: 빔을 공간적으로 결합하고 광학 지연 선을 사용하여 레이저의 시간적 중첩을 얻기 위해 적절한 이색 거울 (즉, 817과 1,064 nm 사이의 절단)을 사용합니다. 펄스.
4. 두 개의 코프로그화 빔이 모두 시준되고 직경이 현미경 내의 광학 시스템에 적합한 유사한 값을 가지고 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 빔을 결합하는 이색 거울 앞에 빔을 별도로 충돌시게 합니다.
5. 적외선 레이저 스캐닝 장치와 듀얼 채널 적색/녹색 에피 검출 유닛을 포함해야 하는 상업용 반전 현미경 시스템을 켜고 코프로그레이저 빔을 스캐닝 유닛에 정렬합니다.
6. 듀얼 채널 에피 감지 장치를 열고 필터 큐브를 제거하고 적색 파장 감지 필터를 817/1,064 nm 펌프/스토크스 여기의 경우 663nm에 중심이 되는 2,840cm^-1 CARS 신호를 선택할 수 있는 밴드패스 필터로 교체합니다. 구성표. 높은 수준의 형광 배경 신호의 수집을 피하기 위해 좁은 대역폭(20nm) 필터가 선호됩니다.
7. 거꾸로 된 CARS 현미경의 무대에 접시를 놓고, 100x 오일 침지 목표를 사용하여, 세포에 초점을 맞추기 위해 목표의 수직 위치를 이동.
8. 127 μm x 127 μm에 걸친 시야에 걸쳐 고해상도(1024 x 1024 픽셀) 이미지를 수집하도록 현미경 소프트웨어를 설정합니다.
9. 현미경 소프트웨어를 설정하여 127 μm x 127 μm 시야의 이미지를 지속적으로 수집하고 표시하고 이미지 수집 매개 변수를 최적화하는 동안 표시된 이미지를 확인합니다. 레이저 파워가 빠른 이미지 수집과 최소한의 손상을 위해 균형을 이루고 필요에 따라 빔 경로에 적절한 중성 밀도 필터를 삽입하고 신호 대 노이즈가 좋은 이미지 수집을 허용하는 픽셀 거주 시간을 선택하십시오. 선택한 레이저 전력 조건하에서 비율을 조절할 수 있습니다.
10. 최적화된 조건에서 접시 내에서 여러 가지 시야의 이미지를 획득하고 저장합니다. 선택적으로, 녹색 파장 방출에 의해 생성된 다광자 형광 이미지(주로 817 nm에서 2광자 여기로부터), 다른 에피 검출기를 통해 동시에 수집될 수 있다. 각 요리에 대해 8.7-8.10단계를 반복합니다.
11. CARS 이미지 분석의 경우 ImageJ의 FIJI 구현을 사용하여 이미지를 처리합니다. 추가 분석을 하기 전에 각 이미지에서 Despeckle 기능(또는 이와 유사한 데노이즈 제거 도구)을 작동하여 세부 사항 손실 없이 신호 대 잡음 비율을 개선합니다.
12. FIJI를 사용하여 수동으로 세포를 선택한 다음 분할된 개별 세포 내에서 지질 방울을 자동으로 계산하여 각 세포와 각 접시에 대한 전체 이미지 데이터 집합에 대한 지질 방울 영역 및 숫자에 대한 통계를 생성합니다.

9. MTT 세포 생존 분석

1. 플레이트는 분화 배양 배지의 최종 100 μL 부피에서 1 x 10⁵ 세포/웰의 밀도를 가진 96웰 플레이트로 HepaRG 세포를 분화하였다.
2. 24 시간 파종 후, 세포를 99 % 메탄올 (비히클)으로 처리하고 100 μM, 250 μM 및 500 μM 나트륨 올레아테 및 나트륨 팔미테를 100 μL에서 희석하여 분화 배양 배지 / 잘 삼중 으로 희석하였다.
3. 매 24시간마다 100 μL에서 희석된 99% 메탄올및 100 μM, 250 μM 및 500 μM 나트륨 올레에이트 및 나트륨 팔미테로 배지를 변경합니다.
4. 96 시간 메탄올/나트륨 올레아테/나트륨 팔미테 처리 후, 100 μL의 분화 배양 배지/잘 에서 희석된 2 μM 독소루비신으로 세포를 대조군으로 치료한다.
5. 18 시간 독소루부신 처리 후, 분화 배양 배지의 100 μL로 배지를 변경한다.
6. 파이펫 20 μL 의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-2-2H-테트라졸륨 시약 MTT(재료표)의 각각의 웰내로 100μil의 세포를 함유하는 도포시플레이트 . 삼중배분 배양 배지의 100 μL에서 세포없이 시약의 20 μL을 잘 대조군으로 파이펫팅하여 배경 제어를 포함한다.
7. 가습, 5% CO2 분위기에서 37°C에서 플레이트를 배양한다.
8. MTT 테트라졸륨 시약으로 30, 60 및 90분 동안 인큐베이션한 후, 96웰 플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 기록하였다. 다른 샘플에 대한 흡광도 값에서 셀 없음 제어 웰의 배경 흡광도를 뺍니다.

결과

이 프로토콜은 나트륨 올레아테 처리에 의해 DMSO 분화 된 헤파RG 세포에서 소포 골수를 유도하고 특성화하는 효율적인 방법을 설명합니다 (도1A).

HepaRG 세포의 분화.
효율적으로 분화를 유도하기 위해 증식 세포는 증식 배지에서 저밀도(2.5 x 10⁴ 세포/cm2)로 시드되어야 합니다. 낮은 밀도에서 시드 할 때, 세포는 적극적으로 분할하고 가늘게 미분화 형태를 취득 (그림1B). 세포는 100% 동급에 도달할 때까지 7일 동안 증식 배지에서 성장하도록 방치되어야 한다(도1C). 2% DMSO에 노출된 후, 세포는 담즙 상피 유사 세포로 둘러싸인 전...

토론

이 프로토콜은 HepaRG 세포를 분화하는 방법과 올레아테나트륨 처리에 의한 포수체 증시를 유도하는 방법을 설명한다(도1A). 실제로, 다른 인간 간세포암(HCC) 세포주와 비교하여, 헤파RG 세포주들은 성인 인간 간세포의 특징을 나타내며, 생체내 배양 된 1차 인간 간세포에 대한 귀중한 대안을 나타내는^{13,14 ,15}. HepaRG 세포주 들은 간 세포 독성 연구, 약물 대사 및 바이러스학 연구^15,16,22에널리 사용되어 왔다.

HepaRG 세포와 비교하여, H...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
하이클론 하이클론 태아 클론 II	GE 헬스케어	SH30066
윌리엄' GlutaMAX가 함유된 s E 매체	써모피셔	32551087
페니실린/스트렙토마이신	SIGMA	P4333
인슐린	SIGMA	I9278
하이드로코르티손 헤미숙시네이	SIGMA	H2270
DMSO, 디메틸설폭사이드	SIGMA	D2438
소듐 올리에이트	SIGMA	O7501
메탄올	SIGMA	179337
이소프로판올	SIGMA	278475
BODIPY 505/515	Thermofisher	D3921
PBS	Thermofisher	14190-250
포름알데히드 용액	SIGMA	252549
RNAse free DNAseI	Promega	M198A
유리 바닥 접시	Willco Wells	GWST-5040
오일 레드 솔루션	SIGMA	O625
CellTiter 96 AQueous One Solution	Promega	G3582
q-PCR 올리고 이름	Sequence
ACACB FOR	CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REV	CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG&
BETA;-ACTIN FOR	GCACTCTTCCAGCCTTCCT
β-actin REV	AGGTCTTTGCGGATGTCCAC
TGCTGAATGTGCTGATGACAGG			에 대한 알부민
REV	AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
알도브	GCATCTGTCAGCAGAATGGA
ALDOB REV	TAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FOR	CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV	CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 FOR	CTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REV	GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A	FOR TCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REV	GCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 FOR	TTGAAGCCTCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REV	CGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 FOR	CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REV	TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FOR	TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REV	AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM FOR	TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REV	ATGCACATCTCTCGCTCTTGAATAA
IL6 FOR	CCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REV	ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4	ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REV	TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2	TTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REV	CCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 FOR	AATGAGTTGGAGGGGGGGGGGGACATC
PLIN4 REV	GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD FOR	TCTAGCTCCTACCACCACCA
SCD REV	TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 FOR	TGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REV	CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG
18S	FOR CGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REV	TTGGCAAATGCTTTCGCTC