성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.
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이 논문에서
요약
초록
Organotypic, 또는 슬라이스 문화, 널리 생체 외에서 작동 하는 중추 신 경계의 측면을 모델링 하기 위해 사용 되었습니다. 신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간 과목에서 그. 슬라이스 배양을 준비하기 위해 성인 인간 조직의 사용은 설치류에서 생산 된 조각 (일반적으로 신생아)에서 생산 된 성숙한 인간의 뇌의 전형적인 독특한 특성을 보유하기 때문에 인간의 신경 병리학에 대한 이해를 향상시키는 데 특히 매력적입니다. 신경 조직. 이 프로토콜은 단기, 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차도 제시된다. 대표적인 결과는 전형적인 인간 피질 적층이 시험관내(DIV4)에서 4일 후에 슬라이스로 보존되고, 주요 신경 세포 유형의 예상 존재와 함께 입증된다. 더욱이, DIV4의 슬라이스는 독성자극(H2O2)에도전할 때 강력한 세포 사멸을 겪으며, 이는 세포 사멸 법제에서 플랫폼역할을 하는 이 모델의 잠재력을 나타낸다. 이 방법은, 막 삽입을 사용하여 널리 사용되는 프로토콜에 대한 간단하고 비용 효율적인 대안, 주로 연령과 관련된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명하기위한 단기 분석법을 실행하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 프로토콜은 약리성 측두엽 간질의 외과 적 치료에 제출 된 환자에서 수집 된 피질 조직을 사용하는 데 전념하지만, 다른 뇌 영역 / 조건에서 수집 된 조직도해야한다고 주장한다. 유사한 자유 부동 슬라이스 문화원을 생성하는 소스로 간주됩니다.
서론
연구에서 인간 샘플의 사용은 명백하게 인간의 뇌 병리학을 연구할 수있는 좋은 옵션이며, 현대 기술은 환자 유래 조직을 사용하여 강력하고 윤리적 인 실험을위한 새로운 방법을 열었습니다. 성인 인간의 뇌에서 준비 된 organotypic / 슬라이스 문화와 같은 방법은 광유전학1,전기 생리학2,3,4,5,가소성과 같은 패러다임에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 6,7,8,9,신경 독성 / 신경 보호10,11,12,13,세포 치료14
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프로토콜
살아있는 성인 뇌 조직은 약전성 측두엽 간질치료를 위한 용단신경외과를 받은 환자로부터 수득하였다(도1A). 모든 절차는 리베이라오 프레토 의과 대학 (17578/2015)의 클리닉 병원에서 윤리위원회의 승인을 받았으며 환자 (또는 법적 책임자)는 정보에 입각한 동의 조건에 동의하고 서명했습니다. 조직의 수집은 간질 외과 센터에서 신경 외과 팀에 의해 수행되었다 (CIREP - 리베라오 프레토 의과 대학에서 클리닉 병원, 상파울루 대학, 브라질).
1. 재료의 살균
참고: 모든 재료와 용액은 사용하기 전에 멸균해야 합니다.
- 모든 수술 도구와 진동 슬라이스 재료 (나이프 홀더, 시편 디스크, 버퍼 트레이)를 180 °C에서 4 시간 동안 건식 살균 오븐에서 살균하십시오.
- UV 또는 감마 조사에 의해 온도에 민감한 물질 또는 장비를 살균하십시오.
- 0.22 μm 기공 멤브레인을 통해 오토클레이브 또는 여과하여 매개체 및 용액을 살균합니다.
2. 솔루션 준비
- 수송 용액의 15-20 mL 준....
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결과
배양된 슬라이스의 품질 및 건강을 평가하는 중요한 양상은 예상되는 신경 세포 유형, 뉴런 및 신경교 세포의 존재 및 전형적인 형태이다. 인간 피질 적층의 전형적인 구조는 DIV4에서 슬라이스에서 관찰되었고, 뉴런 면역 표지에 의해밝혀졌다(도 2D). 또한, 마이크로글리아 및 아스트로글리아의 예상존재(도 2B,C)도관찰되었다. 이러한 결과는 조직 구조가 외과 적 절차 / 샘플 처리 또는 시험관 내 단기 기간에 의해 크게 영향을받지 않는다는 것을 보여줍니다. 이전 연구 결과에 따르면, NeuN 면역 반응성은 DIV0 및 DIV432사이에서 변경되지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과에 기초하여, 슬라이스의 감소된 두께에 연관된 자유 부동 배양 형식(멤브레인 삽입이 사용될 때 널리 사용되는 300-400 μm에 비해), 내부 .......
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토론
자유 부동, 단기 슬라이스 배양을 생산하기위한이 프로토콜은 성인 인간 신피질 조각을 배양하기위한 대체 방법입니다. 슬라이스 배양에 대한 이러한 프로토콜은 광유전학1,44,45,전기 생리학2,3,4,5에 대한 연구에 적합할 수 있습니다. , 단기 가소성46,47,장기 가소성48,49,신경 독성 / 신경 보호
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 FAPESP에 의해 지원된다 (그랜트 25681-3/2017 에 AS), CAPES (박사 후 펠로우십 PNPD / INCT-HSM A.F.와 N.D.M.에 박사 전 펠로우십) 및 FAEPA. G.M.A.는 FAPESP (MS 2018/06614-4)에서 석사 펠로우십을 보유하고 있습니다. N.G.C.는 CNPq 연구 펠로우십을 보유하고 있습니다. 우리는 이 연구 결과에 대한 절제된 조직을 기증해 준 환자와 그들의 가족에게 감사드립니다. 우리는 리베이라오 프레토 의과 대학, 상파울루 대학의 임상 병원에서 주민, 간호사, 기술자 및 CIREP 팀의 지원을 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-프로판올 | Merck | 1096341000 | |
| 아크릴아미드/비스-아크릴아미드, 30% 용액 | 시그마 알드리치 | A3449 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| 항체 anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
| Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Bradford 1x 염료 시약 | BioRad | 500-0205 | |
| EDTA | Sigma | T3924 | RIPA 완충액에 사용 |
| 포도당 | Merck | 108337 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
| Mouse IgG, HRP linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | RIPA 완충액에 사용 |
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| 무지방 분유(Molico) | Nestlé | 멤브레인 차단에 사용 | |
| PBS 완충액 pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
| Penicilin/Streptomicin | 시그마 Aldrich | P4333 | |
| 염화칼 | Merck | 1049361000 | |
| 프라임 웨스턴 블로팅 감지 시약 | GE | RPN2232 | |
| 토끼 IgG, HRP 연결 전체 Ab(토끼 방지) | GE | NA934-1ML | |
| SDS | Sigma | L5750 | RIPA 완충액에 사용됨 |
| TEMED | GE | 17-1312-01 | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
| Tris | Sigma | T-1378 | RIPA 완충액에 사용됨 |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | RIPA 완충액에 사용됨 |
| 초순수 | Millipore | MiliQ 정수 시스템에서 파생된 멸균수 | |
| Equipment and Material | |||
| 24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with |
| Lid Amersham Potran Premium (니트로셀룰로오스 막) | GE | 29047575 | |
| 탄화물 혼합물 | 화이트 마틴 | 95% O2, 5% CO2 | |
| CO2 인큐베이터 | 뉴브런즈윅 사이언티픽 | CO-24 | 슬라이스 5% CO2, 36º의 인큐베이션; C |
| 마이크로플레이트 리더 | 분자 장치 | ||
| 마이크로튜브 | Greiner | 001608 | 1,5mL 마이크로튜브 |
| 전동 유봉 | 킴블 체이스 | ||
| 플라스틱 숟가락 | 디저트 숟가락의 크기 | ||
| 면도날 | Bic | Chrome Platinum, 비브라톰 | |
| 메스 블레이드 | 로 자르는 데 사용Becton Dickinson (BD) | Number 24 | 조직의 슬라이싱에 사용됨; 권장 같은 크기 또는 더 작은 |
| Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | 구성: Etilcianoacrilato; 2-프로펜산; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; 호모폴리머 | |
| Vibratome | 라이카 | 14047235612 - VT1000S | |
| Immunohistochemistry | |||
| Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore를 | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
| Anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
| Antibody anti-IBA1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 - ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
| Biotinylated anti-mouse IgG 항체 (H+L) | Vector | BA-9200 | |
| DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
| Entellan | Merck | 107960 | |
| 에탄올 | Merck | 1.00983.1000 | |
| 젤라틴 | 합성 00G1002.02.AE | 슬라이드 코팅에 사용 | |
| Microtome | Leica | SM2010R | 동결 스테이지 (BFS-10MP, Physiotemp) 장착, -40º으로 설정; C |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Rabbit IgG, HRP 연계 whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
| Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
| Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
| Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, 키트 표준 | |
| 자일렌 | 신디사이 | 01X1001.01.BJ |
참고문헌
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
- Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophy....
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재인쇄 및 허가
