이 방법의 목적은 형광표지된 혈관이 있는 제브라피시 배아로 포유류 종양 세포를 이종이식에 이식함으로써 종양 혈관신생의 생체 내 모델을 생성하는 것이다. 이종이식 및 관련 혈관을 이미징함으로써, 혈관신생 반응의 정량적 측정을 얻을 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 혈관신생은 항암 치료의 주요 표적이며 이 방법은 생체 내에서 이 과정을 연구하는 새로운 모델을 제공하기 위해 개발되었다. 제브라피시 이종이식은 포유류 종양 세포를 2일 후 수정 후 제지피시 배아의 연막 공간에 이식한 다음, 최대 2일까지 실험 종점에서 관찰된 혈관신생 반응의 정도를 측정하여 생성됩니다. 이식 후. 이 방법의 주요 장점은 접목에 대한 제브라피쉬 숙주 혈관신생 반응을 정확하게 정량화하는 능력이다. 이것은 혈관 신생 반응에 호스트 대 종양 기여뿐만 아니라 분자 메커니즘의 상세한 검사를 가능하게합니다. 이종이식 된 배아는 종양 혈관 신생을 억제하는 전략을 조사하기 위해 잠재적 인 항 혈관 신생 약물을 사용하여 배양하는 것과 같은 다양한 치료를 받을 수 있습니다. 혈관 신생 반응은 또한 더 역동적 인 세포 과정을 검사하기 위해 라이브 이미지 화 될 수있다. 상대적으로 까다로운 실험 기술, 제브라피시의 저렴한 유지 보수 비용 및 짧은 실험 타임 라인은 종양 혈관 신생을 조작하는 전략의 개발에 특히 유용합니다.
서론
혈관신생은 암의 고전적인 특징 중 하나이며 항암 치료1,2의표적을 나타낸다. 이 과정을 연구하기 위해, 암의 이종이식 모델은 마우스3과같은 동물에 포유류 종양 세포를 이식함으로써 생성되었다. 제브라피시 이종이식 모델도 개발되어 종양 세포를 2일 후 수정(dpi) 제브라피쉬로 이식하여 제브라피시 혈관이 이종이식으로급속히 성장하게 된다4.
이 프로토콜은 혈관신생 반응이 전체 이종이식에 걸쳐 정확하게 정량화될 수 있는 생체 내 제브라피쉬 배아 종양 이종이식 모델을 기술한다. 이 방법은 조사자가 종양 혈관신생 반응을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 생체 내에서 검사할 수 있게 한다. 제브라피시의 유전성성은 숙주 기여도를 심문할 수 있게 하고, 다른 종양 세포주를 선택하면 혈관신생에대한 종양 기여도도 5,6,7을검사할 수 있다. 또한, 제브라피쉬 유충이 소분자에 투과성됨에 따라, 특정 경로 억제제가 사용....
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프로토콜
1. 미세 주사 바늘의 준비
- 마이크로파이펫 풀러를 켜고 다음 파라미터(재료 표에 나열된 마이크로파이펫 풀러 모델에 대해 보정됨): 열, 680; 당기기, 75; 속도, 40; 시간, 55; 압력: 530.
- 보로실리케이트 유리 모세관을 마이크로파이펫 풀러에 고정하고 모세관을 당겨 두 개의 바늘을 만듭니다. 원하는 만큼 바늘을 반복하십시오.
2. 이식용 세포 배양
참고: 이 프로토콜을 사용하는 경우, 모든 포유류 암 세포주가 제브라피시 배아에 이식하는 데 이종이식으로 사용될 수 있다. 그러나, 상이한 세포주5,11,12사이에서 유도된 혈관신생 반응에 많은 변이가 있다. B16-F1 뮤린 흑색종 세포는 제브라피쉬 배아(11)에서 강한 혈관신생 반응을 유도하는 것으로 나타났으며 따라서 이 프로토콜에서 사용하기에 적합하다.
- B16-F1 세포를 75 cm 2 플라스크에서 7....
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결과
6, 24 및 48 hpi에서 개별 이종이식을 이미징함으로써, 상이한 시점에서의 혈관신생 반응은 도 1A-C에 도시된 바와 같이 계산될 수 있다. 가장 큰 혈관 신생 반응은 이식 후 24-48 시간 사이에서 관찰되며, 접목 혈관의 최대 수준은 2 dpi (그림1A-C)에서볼 수 있습니다. B16-F1 이종이식에 대한 전형적인 혈관신생 반응의 타임랩스 영화는 20.75hpi에서 46hpi까지의 보조 영상1에서 볼 수 있다. 이 영화는 이 프로토콜에 따라 이식된 이종이식을 2 dpf kdrl:EGFP 배아로 이미징함으로써 생성되었다. 이종이식을 통해 성장하는 혈관은 불규칙한 크기와 형태학의 혈관을 가진 고난의 네트워크를 형성하며, 이는 포유류
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토론
프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 종양 세포의 이식입니다. 세포가 배아 부종을 만들지 않고 배아에 성공적으로 이식 할 수있는 위치에 세포를 주입하는 것이 필수적입니다. 너무 앞쪽인 주사는 세포가 심장쪽으로 움직이도록 허용하여 혈류를 차단하고 부종으로 이어질 수 있으며, 너무 후방인 주사는 이식이 제대로 되지 않습니다. 전방 주사는 주입으로 심혼에서 멀리 가리키도록 후방 방향으로 전방에 있는 노른자 낭을 통해서 바늘을 삽입해서 피하는 것이 가장 좋습니다. 후부 주사는 노른자 낭의 둥근 부분의 앞쪽 절반에 있는 위치에 세포를 주입하 여 가장 잘 피할 수 있습니다. 또한, 세포는 노른자 낭에 복부를 주입해야하며 횡측이 아닌 측면 위치가 더 어렵고 이후에 이미지가 야합니다. 일단 연구원이 이 프로세스에 합리적으로 숙달되면, 대략 200-300의 태아는 매일 이종이식으로 이식될 수 있습니다. 혈관 신생 반응의 이미징은 이종이식을 장착하고 이미지화하는 데 걸리는 시간 으로 인해 더 오래 걸릴 것입니다. 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 오클랜드 제브라피시 대학과 오클랜드 대학 의학 과학 대학, 의학 대학, 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 뉴질랜드 프로젝트 보조금의 건강 연구 위원회 (14/105), 뉴질랜드 마스덴 기금 프로젝트 보조금의 왕립 학회 (UOA1602) 및 오클랜드 의학 연구 재단 프로젝트 보조금 (1116012) J.W.A에 수여에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 에어 실린더 | BOC | 011G | 이종 이식 |
| B16-F1 세포 | ATCC | 세포 배양 | |
| BD Matrigel LDEV-free (세포 외 매트릭스 혼합물) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate 유리 모세관 | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, 길이 = 10 cm 세포 주입 |
| 셀 배양 접시 직경 35 mm | Thermofisher NZ | NUN153066 | 어류 축산 |
| 세포 배양 접시 직경 100 mm | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | 어류 축산 |
| 세포 배양 플라스크 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | 세포 배양 |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | 세포 라벨링, 스톡 농도 (DMSO에서 10 mM), 작업 농도 (0.2 & 무혈청 배지의 M) |
| 디메틸 설폭시드 | 시그마-알드리치 | D8418 | 약물 처리, 세포 표지 |
| E3 배지(물 2L에 60배) 34.8g NaCl 1.6g KCl 5.8g CaCl2· 2H2O 9.78 g MgCl2· 6H2O는 NaOH로 pH 7.2로 조정 | 집 [1] | 양어장 | |
| 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트 (트리카인) | 시그마 - 알드리치 | E10521 | 이종 이식, 이미징 |
| 필터 팁 1,000 μ L | VWR | 732-1491 | 여러 단계에서 사용 |
| 필터 팁 200 μ L | VWR | 732-1489 | 여러 단계에서 사용 |
| 필터 팁 10 μ L | VWR | 732-1487 | 여러 단계에서 사용 |
| 형광 현미경 | Leica | MZ16FA | 배아 준비 |
| FBS (뉴질랜드 유래) | Thermofisher Scientific | 10091148 | 세포 배양 |
| 장갑 | 모든 상업 브랜드 | 여러 단계에서 사용 | |
| 혈구계 세포 계수 챔버 개선 Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | 이종 이식 |
| Heraeus Multifuge X3R 원심분리기 | Thermofisher Scientific | 75004500 세포 배양, 세포 라벨링 | |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | 세포 라벨링, 재고 농도 (DMSO에서 1 mg/ml), 작업 농도 (6 μ 혈청이 없는 매체의 g/ml) |
| 낮은 융점, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | 이미징 |
| 메티셀룰로오스 | 시그마-알드리치 | 9004 67 5 | 이종 이식 |
| 메틸렌 블루 | 시그마-알드리치 | M9140 | 양류 마이크로 |
| 로더 0.5-20 μ L microcapillaries 로딩용 피펫 팁 | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | 여러 단계에서 사용되는 | 모든 상용 브랜드 | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| 현미경 케이지 인큐베이터 | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | 이미징 | |
| 미네랄 오일 | Sigma-Aldrich | M3516 | 이종 이식 |
| 최소 필수 매체(MEM) - 알파 | Thermofisher Scientfic | 12561056 | 세포 배양 |
| MPPI-2 압력 인젝터 | 응용 과학 기기 이 | 종 이식 | |
| Narishige 미세 조작기 | Narishige Group | 이종 이식 | |
| Nikon D Eclipse C1 컨포칼 현미경 | Nikon | 이미징 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | 양산 |
| PBS | Gibco | 10010023 | 세포 배양 |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15140122 | 세포 배양 |
| S1 피펫 필러 | Thermoscientific | 9501 | 세포 배양 |
| 혈청학적 스트라이프렛 10 mL | Corning | 4488 | 세포 배양 |
| 혈청학적 스트라이프렛 25 mL | Corning | 4489 | 세포 배양 |
| 혈청학적 스트라이프렛 5 mL | Corning | 4485 | 세포 배양 |
| 혈청학적 스트라이프렛 2 mL | Corning | 4486 | 세포 배양 |
| 테루모 바늘 22 G | Amtech | SH 182 | 양어업 |
| 조직 배양 인큐베이터 | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | 세포 배양 |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | 약물 처리 | |
| 이송 피펫 3 mL | Mediray | RL200C | 양산 |
| 트립신/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | 세포 배양 |
| 핀셋 | Fine Science Tools | 11295-10 | 양어류 |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | 이미지 분석 |
참고문헌
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Rese....
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재인쇄 및 허가
