뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

요약

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

γδ T 세포 수용체 (γδ IEL)를 발현하는 상피 내 림프구는 장 상피의 면역 감시에 중요한 역할을한다. γδ T 세포 수용체에 대한 확실한 리간드의 부족으로 인해, γδ IEL 활성화및 생체 내의 이들의 기능의 조절에 대한 우리의 이해는 제한적이다. 이것은 γδ IEL 기능 및 국부적인 미세 환경에 대한 이 세포의 반응성에 관여하는 신호 통로를 심문하는 대체 전략의 개발을 필요로 합니다. γδ IELs는 병원체 전좌를 제한하기 위하여 넓게 이해되더라도, intravital 화상 진찰의 사용은 안정상태에서 및 침략적인 병원체에 응하여 IEL/상피 상호 작용의 좌측 시간 역학을 이해하는 것이 중요했습니다. 본 명세서에서, 우리는 역회전 디스크 공초점 레이저 현미경을 사용하여 GFP γδ T 세포 리포터 마우스의 소장 점막에서 IEL 철새 거동을 시공하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 접근법의 최대 이미징 깊이는 2광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법의 사용에 비해 제한적이지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경 은 광표백을 감소시키고 고속 이미지 수집의 이점을 제공합니다. 사진 손상. 4D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 T 세포 감시 동작과 이웃 세포와의 상호 작용을 실험 조작 후 분석하여 장 점막 내IEL 활성화 및 기능에 대한 추가 적인 통찰력을 제공합니다.

서론

상피 내 림프구(IEL)는 장 상피 내에 위치하며, 지하막을 따라 그리고 세포간 공간 내의 인접 한 상피 세포 사이에모두 발견된다 1. 5-10개의 상피 세포마다 약 1개의 IEL이 있습니다. 이러한 ILS는 장 상피 장벽2의 큰 창공의 면역 감시를 제공하는 센티넬역할을 한다. γδ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 ILs는 뮤린 소장에서 총 IEL 집단의 최대 60%를 포함한다. γδ T 세포 결핍 마우스에 대한 연구는 장 손상, 염증 및 감염에 대한 응답으로이들 세포의 크게 보호 역할을 입증 3,^4,5. Tcrd 녹아웃 마우스 6의생성에도 불구하고, γδ IEL 생물학에 대한 우리의 이해는 γδ TCR에 의해 인식된 리간드가 아직 확인되지 않았다는 사실로 인해 부분적으로 제한적으로 남아 있다^7. 그 결과, 이러한 세포 집단을 연구하는 도구의 부족으로 인해 생리적 및 병리학적 조건 하에서 γδ TCR 활성화 및 기능의 역할을 조사하기가 어....

프로토콜

모든 연구는 Rutgers 뉴저지 의과 대학 비교 의학 자원에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 실험실 동물 관리 (AALAC)-공인 시설의 평가 및 인증의 협회에서 수행되었다.

1. 마우스 준비

참고: 동물 제제 및 수술을 포함한 다음 절차는 수술 전에 30-40 분이 소요되며 현미경을 켜고 동봉 된 인큐베이터를 현미경으로 37 °C로 따뜻하게합니다.

1. 버나드 말리센 (INSERM, 파리, 프랑스)에서 얻은 C57BL/6 배경에 8-10주 된 TcrdEGFP 마우스에 대한 실험을 수행하였다. IACUC 승인 절차에 따르면, 동물의 무게에 따라 케타민 (120 mg/kg)과 자일라진 (10 mg / kg)을 i.p. 주입하여 마우스를 마취시다. 호흡 속도 (분당 55-65 호흡)^21,발가락 핀치 및 팔피브랄 반사로 마취 수준을 평가하십시오.
2. 수술용 평면 마취에 도달하면 테이프를 사용하여 마우스의 뒷다리를 가열 패드에 고정하여 직장 온도계로 모니터링할 수 있는 체온을 유지합니다. 마취가 벗겨지고 있다는 징후가 있는 경우(예: 호흡 속도 증가, 깜박임 및/또는 팔피브랄 반사에 대한 눈 근육 경련....

결과

TcrdEGFP 리포터 마우스의 intravital 화상 진찰을 사용하여, 우리는 이전에 γδ IELs가 지하 막을 따라 그리고 측면 세포 간 공간 (LIS)로 이동하여 상피를 순찰하는 동적 감시 행동을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 상태(그림2,동영상 1)를 참조하십시오.

이 접근법은 또한 특정 세포 신호화 경로 및/또는 수용체의 억제가 γδ IEL 철새 거동에 미치는 영향을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인터류킨(IL)-15는 γδ IEL 항상성^23,24에필수적인 흉막사이토카인이다. IL-2Rβ 수용체를 통한 IL-15 신호가 안정상태에서 γδ IEL 운동성의 역학에 기여하는지 여부를 확인하기 위해, TcrdEGFP 리포터 마우스는 항-IL-2Rβ 항체(TM-β1) 또는 이소.......

토론

사내 현미경 기술의 발달은 세포 내 구조의 재구성을 관찰 할수있는 전례없는 기회를 제공했다 8,^9,22,세포 - 세포 상호 작용^{12, 25} 및 세포 이동 거동^{13,14,15,16,26} 그렇지 않으면 접근할 수 없는 조직에서. 생체 내 18,^27에서γδ IELs의 조절.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 접시, No. 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide 피하 주사 바늘 - 27G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD 슬립 팁 멸균 주사기 - 1mL	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD 투베르쿨린 주사기	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
해부 가위	Thermo Fisher Scientific	08-940
전기 소작	Thermo Fisher Scientific	50822501
밀폐형 배양 챔버	OKOLAB		현미경
눈 바늘, 크기 #3; 1/2 원, 테이퍼 포인트, 12mm 현 길이	Roboz	RS-7983-3
Hank's 균형 잡힌 소금 솔루션	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) 시작, 트랙, XT 모듈	Bitplane		Software
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
	Ketamine Putney		Anesthesia
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas 가위 3 " (7.5 cm) 긴 5 x 0.15mm 스트레이트 샤프	Roboz	RS-5600
비흡수성 수술용 봉합사, 실크 스풀, 블랙 브레이디드	피셔 사이언티픽	NC0798934
뉴젠트 집게 4.25" (11cm) 긴 각진 부드러운 1.2mm 팁	Roboz	RS-5228
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